協(xié)同增效頭孢噻呋鈉的MRSA抑制劑的篩選

郝紅俠，任海燕，胡龍飛，劉旭東，趙紅瓊，郝智慧

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，中獸醫(yī)藥研究中心，北京 100193； 3.青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)用生物制藥實驗室，山東青島 266109)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是引起臨床感染性疾病的重要的人獸共患病原菌，由于它多重耐藥、傳染性強且難以控制，臨床感染可引起膿毒癥、肺炎或奶牛乳房炎[1]等。動物出現(xiàn)免疫功能減弱、反復感染、發(fā)病率和死亡率上升，給畜牧行業(yè)帶來嚴重經(jīng)濟損失。目前獸醫(yī)臨床對其感染的疾病治療可用的抗生素有限,尋找有效的耐藥抑制劑協(xié)同增效抗生素防控MRSA非常必要。本文從多種黃酮類中藥單體和海洋生物材料中篩選出可以增強頭孢噻呋鈉對MRSA敏感性的活性成分，為獸醫(yī)臨床針對MRSA感染治療提供輔助藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 MRSA菌株ATCC 33591購自上?？戮S化學技術有限公司，金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 29213(Staphylococcusaureus)和臨床耐藥金葡菌株為本實驗室保存菌種。

1.1.2 藥品與試劑 78種黃酮類中藥單體標準品購自成都瑞芬思生物科技有限公司，規(guī)格均為5 mg，具體名稱和批號為：原花青素(4852-22-6)，二氫楊梅素(27200-12-0)，巴西蘇木素(474-07-7)，血竭素高氯酸鹽(125536-25-6)，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(7084-24-4)，西伯利亞遠志口山酮 (B20633-67-4)，山奈酚3-O-桑布雙糖苷(27661-51-4)，亥茅酚苷(80681-44-3)，丹皮酚(552-41-0)，葒草苷(28608-75-5)，蒿甲醚(71963-77-4)，水仙苷(604-80-8)，毛蕊異黃酮(241125-81-5)，槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷(22688-79-5)，楊梅苷(17912-87-7)，千層紙素A-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷(36948-76-2)，5,7-二羥基色原酮(31721-94-5)，3′-羥基葛根素(117060-54-5)，三葉豆紫檀苷(6807-83-6)，斯皮諾素(72063-39-9)，甜橙黃酮(2306-27-6)，朝藿定A1(140147-77-9)，水飛薊亭(33889-69-9)，7-O-甲基芒果苷(31002-12-7)，朝藿定C(110642-44-9)，柯因二甲醚(21392-57-4)，百蕊草素I(40437-72-7)，遠志山酮Ⅲ(162857-78-5)，5-O-甲基維斯阿米醇苷(84272-85-5)，曲克蘆丁(7085-55-4)，異葒草素(4261-42-1)，黃芪總黃酮，野鳶尾苷(491-74-7)，葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷(861691-37-4)，葛根素芹菜糖苷(103654-50-8)，異槲皮苷(482-35-9)，3′,4′,5,7-四甲氧基黃酮(855-97-0)，新甘草苷(5088-75-5)，升麻素(80681-45-4)，白麻苷(18609-17-1)，扁蓄苷(572-30-5)，異橙黃酮(17290-70-9)，山奈苷(482-38-2)，芹糖異甘草苷(120926-46-7)，淫羊藿苷(110623-73-9)，黃杞苷(572-31-6)，芒果苷(4773-96-0)，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(29741-09-1)，王不留行黃酮苷(53452-16-7)，柚皮苷二氫查爾酮(18916-17-1)，6′′′-阿魏酰斯皮諾素(77690-92-7)，新橙皮苷(13241-33-3)，新芒果苷(64809-67-2)，漆黃素(528-48-3)，圣草次苷(13463-28-0)，新橙皮苷二氫查爾酮(20702-77-6)，異牡荊素(38953-85-4)，異鼠李素-3-O-新橙皮苷(55033-90-4)，大豆苷(552-66-9)，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(578-74-5)，香蒲新苷(104472-68-6)，落新婦苷(29838-67-3)，淫羊藿次苷(I56725-99-6)，橙皮苷520-26-3)，蘆薈苷B(28371-16-6)，銀椴苷(20316-62-5)，朝藿定A(110623-72-8)，桑皮苷C(102841-43-0)，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷(60778-02-1)，異甘草苷(120926-46-7)，虎杖苷27208-80-6)，朝藿定B(110623-73-9)，羥基紅花黃色素A(146087-19-6)，甘草苷元-7-O-D-芹糖-4′-O-D-葡萄糖苷(74639-14-8)，香蜂草苷(14259-47-3)，黃豆黃苷(40246-10-4)，升麻素苷(17086-76-9)，杯莧甾酮(80681-45-4)。80種海洋生物材料LXQ-N由山東大學提供。頭孢噻呋鈉(89.4%，HBW180901-15)購自湖北威德利化學科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 雙人單面垂直超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司產(chǎn)品；自動立式壓力蒸汽滅菌器，致微儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩培養(yǎng)箱和生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品；便攜式細菌濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 中藥單體用DMSO溶解配制成5 mg/mL的儲備母液，4℃冰箱儲存；海洋生物材料LXQ-N用DMSO溶解配制成5 mg/mL的儲備母液，4℃冰箱儲存；頭孢噻呋鈉配制成5 120 μg/mL作為儲備母液，在-20℃冰箱儲存。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)測定 以MRSA菌株ATCC 33591作為試驗菌株，用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法[2]進行各中藥單體、海洋生物材料、頭孢噻呋鈉的MIC的測定。

1.2.3 聯(lián)合藥敏試驗 為了檢測兩種活性成分聯(lián)合應用后對MRSA的抗菌效果采用微量棋盤稀釋法[3]進行，即中藥單體、海洋生物材料與頭孢噻呋鈉聯(lián)用。以金黃色葡萄球菌ATCC 29213作為質(zhì)控菌株，MRSA菌株ATCC 33591為試驗菌株。

菌懸液的制備：將凍存管里的ATCC 29213、ATCC 33591三區(qū)劃線接種于BHI瓊脂上，36℃培養(yǎng)后，挑取單克隆菌落于MH肉湯中，36℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。調(diào)整濁度到0.5麥氏濁度(濃度約108CFU/mL)，然后將該菌液稀釋100倍，使菌液濃度為106CFU/mL，作為試驗菌液。

以MIC結果為參考依據(jù)，微量稀釋棋盤法采用96孔無菌微孔板，設計兩藥1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍和1/32倍MIC進行聯(lián)合。兩種藥物分別再進行稀釋，橫列稀釋中藥單體或海洋生物材料，在96孔板中進行梯度稀釋，每孔50 μL?？v列加的是抗生素藥物，提前在離心管中進行梯度稀釋，每種孔50 μL。試驗菌液混勻后用8孔道移液器加入至96孔板的各孔中，每孔100 μL。同時設置中藥單體、抗生素的單獨MIC、陰性和陽性孔做對照。并置于36℃培養(yǎng)，觀察結果并記錄。

FICI計算及結果判斷[4]：

FIC指數(shù)判讀標準：當FIC≤0.5時，為協(xié)同增效作用；當0.52時，為拮抗作用。

1.2.4 最小殺菌濃度(MBC)測定 根據(jù)上述結果，對頭孢噻呋鈉、原花青素的MBC和兩者聯(lián)用時的MBC進行測定。以MRSA菌株ATCC 33591為試驗菌株。取最后一個可見菌生長的含藥孔和隨后每個透明孔的培養(yǎng)物100 μL，均勻涂于MH瓊脂平板，36℃培養(yǎng)24 h。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果

以肉眼觀察到無細菌生長的最小濃度為該藥的MIC，頭孢噻呋鈉對金葡質(zhì)控菌ATCC 29213的MIC分別為0.25 μg/mL，符合質(zhì)控范圍(表1)，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、原花青素、二氫楊梅素、巴西蘇木素、血竭素高氯酸鹽對金葡菌有較好的抑菌作用，對ATCC 33591的MIC分別為400、100、100、25、25 μg/mL，與頭孢噻呋鈉聯(lián)合時呈現(xiàn)協(xié)同或相加作用。而其他中藥單體對ATCC 33591的作用效果均不明顯，MIC值>200 μg/mL，F(xiàn)IC值為1.5，與頭孢噻呋鈉聯(lián)合作用時均呈現(xiàn)無關作用。

海洋生物材料LXQ-2、LXQ-3、LXQ-4、LXQ-8、LXQ-10、LXQ-15、LXQ-16、LXQ-19、LXQ-32、LXQ-33、LXQ-37、LXQ-38、LXQ-39、LXQ-40、LXQ-46、LXQ-69、LXQ-71、LXQ-76、LXQ-80、LXQ-84、LXQ-85、LXQ-89、LXQ-90、LXQ-93、LXQ-100、LXQ-116、LXQ-123對ATCC 29213的MIC均為200 μg/mL，對ATCC 33591的抗菌效果不明顯，而其他海洋生物材料未檢測到對金葡菌的抗菌效果。

表1 頭孢噻呋鈉單用及與中藥單體聯(lián)合對ATCC 33591的MIC和FICI測定結果

2.2 聯(lián)合藥敏試驗結果

2.2.1 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷與頭孢噻呋鈉對MRSA的聯(lián)合藥敏試驗結果 100μg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷能增強頭孢噻呋鈉對ATCC 33591的抗菌效果；100 μg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(即采用1/4 MIC濃度)與頭孢噻呋鈉聯(lián)用對ATCC 33591的MIC由32 μg/mL降至0.125 μg/mL，F(xiàn)ICI為0.2539。表明100 μg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷逆轉了ATCC 33591對頭孢噻呋鈉的耐藥(CLSI規(guī)定對頭孢類抗生素的耐藥折點為4 μg/mL)。

2.2.2 二氫楊梅素與頭孢噻呋鈉對MRSA的聯(lián)合藥敏試驗結果 12.5μg/mL的二氫楊梅素能增強頭孢噻呋鈉對ATCC 33591的抗菌效果；12.5 μg/mL的二氫楊梅素(即采用1/8MIC濃度)與頭孢噻呋鈉聯(lián)用對ATCC 33591的MIC由32 μg/mL降至8 μg/mL，F(xiàn)ICI為0.375。表明12.5 μg/mL的二氫楊梅素可以降低ATCC 33591對頭孢噻呋鈉的耐藥。

2.2.3 原花青素與頭孢噻呋鈉對MRSA的聯(lián)合藥敏試驗結果 25 μg/mL的原花青素能增強頭孢噻呋鈉對ATCC 33591的抗菌效果；25 μg/mL的原花青素(即采用1/4 MIC濃度的)與頭孢噻呋鈉聯(lián)用對ATCC 33591的MIC由32 μg/mL降至4 μg/mL，F(xiàn)IC為0.375。表明25 μg/mL的原花青素逆轉了ATCC 33591對頭孢噻呋鈉的耐藥。

2.2.4 原花青素與頭孢噻呋鈉對MRSA和PRSA臨床菌株的聯(lián)合藥敏試驗結果 原花青素和頭孢噻呋鈉對20株山東豬源的臨床耐藥菌株包括10株MRSA(mecA+，blaZ+)和10株PRSA(blaZ+)的聯(lián)合抗菌結果見表2和表3。

具有mecA基因的MRSA臨床菌株對頭孢噻呋鈉大部分表現(xiàn)出高度耐藥，MIC值≥4 μg/mL。原花青素與頭孢噻呋鈉聯(lián)用后，10株MRSA臨床菌株菌里有8株菌的聯(lián)合耐藥指數(shù)為0.3125～0.5000，說明兩者之間具有良好的協(xié)同增效作用。對于blaZ基因陽性而mecA基因陰性的PRSA產(chǎn)酶菌株(10株)，原花青素與頭孢噻呋鈉聯(lián)用后，PRSA臨床菌株的聯(lián)合耐藥指數(shù)為0.625～0.750，說明兩者之間具有相加作用。原花青素與頭孢噻呋鈉聯(lián)合用藥后，對MRSA臨床菌株呈現(xiàn)協(xié)同增效作用，對PRSA臨床菌株呈現(xiàn)相加抗菌作用。

2.2.5 最小殺菌濃度(MBC)測定結果 頭孢噻呋鈉、原青花素對ATCC 33591的MBC分別為64 μg/mL和300 μg/mL。不同濃度的原花青素都能夠明顯降低頭孢噻呋鈉的MBC，100 μg/mL原花青素可使頭孢噻呋鈉對ATCC 33591的MBC由64 μg/mL降至4 μg/mL，下降16倍。而加入50、25、12.5、6.25 μg/mL原花青素時，頭孢噻呋鈉的MBC分別為8、16、16、32 μg/mL，分別下降8、4、4、2倍，驗證了原花青素與頭孢噻呋鈉聯(lián)用對ATCC 33591協(xié)同增效作用。

3 討論

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、二氫楊梅素、原花青素、巴西蘇木素、血竭素高氯酸鹽對ATCC 33591的MIC分別為400、100、100、25、25 μg/mL；原花青素、二氫楊梅素和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷這3種中藥單體與頭孢噻呋鈉聯(lián)合應用對ATCC 33591均具有明顯的協(xié)同增效作用，F(xiàn)IC分別為0.375、0.375、0.2539。其中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對MRSA的協(xié)同增效抗菌效果比原花青素、二氫楊梅素明顯。巴西蘇木素和血竭素高氯酸鹽對ATCC 33591的抗菌效果非常顯著，但與頭孢噻呋鈉聯(lián)用是相加抗菌作用，單體均呈現(xiàn)無關作用；27種海洋生物材料對ATCC 29213抗菌效果良好，其MIC均為200 μg/mL，而對ATCC 33591的抗菌效果不明顯?？紤]到原花青素的藥理活性多，如抗菌、抗氧化活性、抗癌、抗高血壓、抗菌抗病毒等，且無毒，因此選用原花青素與頭孢噻呋鈉對MRSA和PRSA臨床菌株進行聯(lián)合藥敏試驗，結果表明兩者聯(lián)用對MRSA臨床菌株呈現(xiàn)協(xié)同增效作用，對PRSA臨床菌株呈現(xiàn)相加作用。最小殺菌濃度(MBC)測定表明12.5 μg/mL原花青素可使頭孢噻呋鈉對ATCC 33591的MBC值由64 μg/mL降至16 μg/mL。

表2 原花青素(PC)與頭孢噻呋鈉聯(lián)合應用對MRSA臨床菌株的MIC和FICI的測定結果

表3 原花青素(PC)與頭孢噻呋鈉聯(lián)合應用對PRSA臨床菌株的MIC和FICI的測定結果

巴西蘇木素作為抗菌的有效成分，其抑菌作用與文獻[5]報道相符。血竭素高氯酸鹽作為血竭的合成化合物，文獻[6]已報道了其抗金黃色葡萄球菌。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷是花青素家族中的一員，其抗菌活性研究較少。二氫楊梅素對金黃色葡萄球菌抗菌作用較好。這3種中藥單體與頭孢噻呋鈉聯(lián)用，均能減少頭孢噻呋鈉的使用量，降低了ATCC 33591對頭孢菌素類藥物的耐藥程度，有潛力成為耐藥菌MRSA的抑制劑，協(xié)同增效用藥已成為近年來削減細菌耐藥研究的重要領域。

中藥有效成分具有低毒價廉、不易產(chǎn)生細菌耐藥、抗菌作用顯著等特點[7]，國內(nèi)外對其協(xié)同增效抗生素的研究已有許多，如高良姜素[8]、青蒿琥酯[9]、異土木香內(nèi)酯[10]、金絲桃素[11]、安石榴苷[12]、紫檀芪[13]均可顯著增加β -內(nèi)酰胺類抗生素對耐藥菌的抗菌活性。

MRSA耐藥抑制劑的開發(fā)和利用會成為治療獸醫(yī)臨床MRSA感染性疾病的有力武器，本文探究了矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、二氫楊梅素、原花青素作為耐藥抑制劑的應用潛力，為研發(fā)協(xié)同增效抗菌、遏制細菌耐藥性的抑制劑提供參考。