豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白家蠶表達(dá)體系的構(gòu)建與鑒定

郎洪武，陳曉春，劉 丹，韋永龍，李軼女，張志芳，楊漢春

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081； 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100094)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)是20世紀(jì)90年代在病豬及一些無明顯臨床癥狀豬體內(nèi)檢測(cè)到的一種新型豬圓環(huán)病毒[1]。該病毒感染后會(huì)出現(xiàn)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystetemic wasting syndrome,PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、豬呼吸系統(tǒng)混合疾病、繁殖障礙綜合征等疾病。PCV2基因組全長1766個(gè)～1768個(gè)核苷酸，其中ORF2基因編碼病毒的主要免疫殼蛋白Cap蛋白。該蛋白與病毒的致病性密切相關(guān)，通過改變病毒的宿主嗜性及病毒蛋白與細(xì)胞間的相互作用機(jī)制，可以使病毒獲得不同的致病性[2-3]。Cap蛋白是PCV2主要免疫原性蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，因此Cap基因是PCV2基因工程疫苗及診斷試劑研制的主要候選基因[4]。此外，ORF2還常用于PCV2的流行病學(xué)分析[5]。

家蠶是繁殖昆蟲桿狀病毒并高效表達(dá)外源蛋白的生物反應(yīng)器。近年用家蠶繁殖昆蟲桿狀病毒并表達(dá)外源蛋白這一技術(shù)，在動(dòng)物疾病的疫苗和治療藥物等研究領(lǐng)域得到了很多應(yīng)用[6]。日本國家動(dòng)物衛(wèi)生研究所用BmNPV體系生產(chǎn)的寵物(貓和犬)預(yù)防重組IL制劑已由日本“TORAY”株式會(huì)社生產(chǎn)并投入市場(chǎng)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所與中國科學(xué)院生化技術(shù)研究所合作，1990年首次用家蠶桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)了人乙型肝炎病毒表面抗原。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所與蘭州獸醫(yī)研究所合作，用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫空衣殼病毒顆?；蚬こ桃呙绾涂袢』蚬こ桃呙缬?008年-2009年分別獲得了農(nóng)業(yè)部遺傳工程安委會(huì)頒發(fā)的安全生產(chǎn)證書和在全國8個(gè)省市可以銷售的銷售證書。本文用家蠶表達(dá)PCV2的Cap蛋白，以期為PCV2基因工程疫苗及診斷試劑的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和抗體 PCV2-1株、PCV2-2株、PCV2-3株、PCV2-4株、PCV2-5株、PCV2-6株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測(cè)室分離鑒定和保存。病毒AcNPV、BmNPV，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室提供；PCV2 Cap蛋白多克隆抗體由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測(cè)室制備和保存。

1.1.2 載體試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 pET-28a、昆蟲轉(zhuǎn)移載體pVL1393、家蠶品種JY1由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室提供；TC-100細(xì)胞培養(yǎng)基干粉和胎牛血清，Sigma公司產(chǎn)品；LipofectamineTM2 000，Invitrogen公司產(chǎn)品；DL 2 000 Plus DNA Marker，全式金生物公司產(chǎn)品；BglⅡ、BamHⅠ和PstⅠ等內(nèi)切酶，NEB公司產(chǎn)品產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 PCR儀、核酸電泳儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；微量移液器，Eppendorf公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，Nikon公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司產(chǎn)品；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和透射電子顯微鏡，Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PCV2Cap基因的克隆 將PCV2-1株、PCV2-2株、PCV2-3株、PCV2-4株、PCV2-5株和PCV2-6株，用表1的引物擴(kuò)增Cap基因ORF2的序列，連接至pMD18T載體，將鑒定正確的陽性克隆分別命名為pMD18T-Cap1、pMD18T-Cap2、pMD18T-Cap3、pMD18T-Cap4、pMD18T-Cap5、pMD18T-Cap6。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 Cap基因擴(kuò)增引物序列

1.2.2 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 將pMD18T-Cap1-6和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，膠回收后進(jìn)行重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建。正確的重組質(zhì)粒命名為pVL(cap1)、pVL(cap2)、pVL(cap3)、pVL(cap4)、pVL(cap5)、pVL(cap6)。

1.2.3 重組桿狀病毒的獲得 將線性化的Bm NPV-ZJ8病毒DNA和pVLcap1-6質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染至約含0.5×106～1×106個(gè)Bm-N細(xì)胞的15 cm2培養(yǎng)瓶中，27℃培養(yǎng)4 d～5 d，至細(xì)胞浮起后，收集上清液用于重組病毒的篩選、純化和擴(kuò)增。

提取rBmNPVcapX的基因組DNA，利用PCR方法分析外源基因整合：參照多角體基因啟動(dòng)子序列在ATG上游40 bp處設(shè)計(jì)一條引物，polh-F:5′-ACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAA-3′，以提取的病毒基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。鑒定是否得到了重組病毒rBmNPVcapX。

1.2.4 Cap蛋白在家蠶中的表達(dá) 將重組病毒培養(yǎng)液按每條105pfu注射五齡幼蠶，待家蠶發(fā)病后，剪掉足，收集蠶血，置-20℃凍存。包被液作為空白對(duì)照，以正常蠶血作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)室制備的Cap蛋白多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體為二抗。用ELISA法檢測(cè)Cap抗原基因在蠶體中的表達(dá)情況。

1.2.5 人工改造Cap7基因的表達(dá)與鑒定 設(shè)計(jì)下述引物：cap2-5F：5′-GAAAAATGGCATCTTCAA CGCCCGCCTCTC-3′和cap2-5R：5′-GAGAGGCG-GGCGTTGAAGATGCCATTTTTC-3′。以Cap5基因的DNA為模板，用cap5F與cap2-5R進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用cap2-5F與cap2R以Cap2基因DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后用cap5F和cap2R作為引物，將相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后共同作為模板進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T載體，測(cè)序驗(yàn)證命名為Cap7。

將人工改造的Cap7基因克隆到轉(zhuǎn)移載體pVL1393中，得pVL(Cap7)。pVL(Cap7)DNA與親本病毒DNA在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，經(jīng)篩查、純化得重組病毒rBmNPV(Cap7)，將rBmNPV(Cap7)按同樣方法感染家蠶，取血淋巴，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，并與商品化空衣殼PCV疫苗對(duì)照，計(jì)算每粒蠶蛹的空衣殼表達(dá)量。

將家蠶中含Cap7表達(dá)產(chǎn)物的一粒蠶蛹的勻漿液，經(jīng)超聲波破碎，15 000 r/min離心10 min去細(xì)胞碎片，上清用270 000 r/min在400 g/L蔗糖密度中離心6 h，所得的沉淀溶于1 mm無菌水中，經(jīng)電鏡觀察PCV2病毒粒子狀態(tài)。

1.2.6 家蠶表達(dá)PCV2空衣殼電鏡觀察結(jié)果 將家蠶中含Cap7表達(dá)產(chǎn)物的一粒蠶蛹的勻漿液，經(jīng)超聲波破碎，15 000 r/min離心10 min去細(xì)胞碎片，上清用270 000 r/min在400 g/L蔗糖溶液中離心6 h，所得的沉淀溶于1 mm無菌水中，電鏡觀察PCV-2病毒粒子狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 不同毒株Cap基因的氨基酸序列比較

豬圓環(huán)病毒株P(guān)CV2-1、PCV2-2、PCV2-3、PCV2-4、PCV2-5和PCV2-6共6個(gè)Cap基因推測(cè)的氨基酸序列分析結(jié)果表明，PCV2-1、PCV2-3、PCV2-4、和PCV2-6的ORF2基因的片段長度均為705 bp，編碼234個(gè)氨基酸。PCV2-2和PCV2-5的ORF2基因的長度均為702 bp，編碼233個(gè)氨基酸。6個(gè)毒株的Cap基因推導(dǎo)的氨基酸序列相似性為86.75%～100%(圖1)。

圖1 6個(gè)不同毒株的Cap基因推測(cè)的氨基酸序列的比較

2.2 不同毒株Cap蛋白在家蠶中的表達(dá)及分析

用制備的Cap蛋白多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體為二抗，通過ELISA檢測(cè)不同重組病毒家蠶中Cap的表達(dá)。結(jié)果表明Cap基因在家蠶中得到了高量的表達(dá)，其中rBmNPV(Cap5)和rBmNPV(Cap2)表達(dá)量相對(duì)較高(圖2)。

1～6.Cap1～Cap6的蛋白表達(dá)量 1-6.rBmNPV(Cap1-Cap6)

比較6個(gè)Cap基因的氨基酸序列，Cap1-4和Cap6的核定位信號(hào)序列基本一致，Cap5的突變位點(diǎn)為F8Y，R12K，S17I和V30D，推測(cè)這可能是引起Cap5高表達(dá)的特征性氨基酸。排除核定位信號(hào)序列，Cap2的其他氨基酸與Cap5相比只有第47位和59位不同，分別為T47A和R59A，推測(cè)是Cap2高表達(dá)的特征性氨基酸。如果將Cap2和Cap5基因進(jìn)行改造，將核定位信號(hào)中的高效表達(dá)氨基酸8Y，12K，17I和30D與編碼序列中47A和59A通過PCR方法集中在一個(gè)Cap基因中，則可能獲得表達(dá)效率更高的Cap基因。

2.3 人工改造基因Cap7基因的序列測(cè)定

根據(jù)Cap1-6蛋白表達(dá)量的差異和Cap1-6氨基酸序列比較，通過融合PCR方法得到改造的Cap基因Cap7，Cap7基因的長度均為702 bp，編碼233個(gè)氨基酸。Cap7基因推導(dǎo)的氨基酸序列與PCV2-5的ORF2氨基酸序列相似性最高，只有2個(gè)氨基酸的差異，氨基酸相似性為99.14%(基因序列具體測(cè)定結(jié)果見表2)。

2.4 人工改造的Cap基因在家蠶中的表達(dá)

取表達(dá)了Cap7的家蠶淋巴液，經(jīng)ELISA檢測(cè)，Cap蛋白的表達(dá)量是Cap5的5.3倍，這充分說明8Y、12K、17I、30D、47A和59A等特征性氨基酸是高效表達(dá)和組裝圓環(huán)病毒空衣殼粒子所必須的。用每毫升含20μg/L的商品化空衣殼PCV2疫苗作為陽性對(duì)照，計(jì)算可得每粒蠶蛹或每毫升蠶血淋巴的空衣殼表達(dá)量為1.2 mg～1.6 mg。

2.5 家蠶表達(dá)PCV2空衣殼電鏡觀察結(jié)果

家蠶中含Cap7蛋白表達(dá)產(chǎn)物的蠶蛹勻漿液純化后，經(jīng)電鏡觀察，病毒粒子已經(jīng)完全純化(圖3)。

2.6 免疫電鏡結(jié)果

蠶蛹經(jīng)超離純化后，可得1.2 mg～1.6 mg的豬圓環(huán)病毒空衣殼，圖4為40倍稀釋后的免疫金標(biāo)記電鏡圖(200 000×)，金粒大小為10 nm。

表2 人工改造基因Cap7序列測(cè)定結(jié)果

圖3 家蠶生物反應(yīng)器中高表達(dá)的病毒空衣殼粒子

圖4 家蠶表達(dá)Cap蛋白形成的病毒空衣殼免疫電鏡圖

3 討論

核衣殼蛋白是豬圓環(huán)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白具有較好的免疫原性，開發(fā)該蛋白作為疫苗，防治豬圓環(huán)病毒病具有良好的效果[7-8]。用桿狀病毒表達(dá)ORF2，能夠折疊成類病毒顆粒，很好地保留了其免疫原性[9-10]。目前，已有包括德國勃林格殷格翰動(dòng)物保健公司的PCV2疫苗和荷蘭英特威、先靈葆雅動(dòng)物保健公司的PCV2疫苗等用桿狀病毒表達(dá)的PCV2的Capsid作為疫苗。由于這些疫苗用昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞來生產(chǎn)，成本高，價(jià)格昂貴，限制了其應(yīng)用和推廣。

用家蠶桿狀病毒表達(dá)ORF2比用sf9細(xì)胞表達(dá)能大大降低生產(chǎn)成本，家蠶在中國歷來就有入藥和食用的傳統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物也無需純化就可以作為口服疫苗使用。本研究在家蠶桿狀病毒中表達(dá)的ORF2不帶任何標(biāo)簽，只能通過抗體來檢測(cè)其表達(dá)狀況，需要構(gòu)建ORF2的原核表達(dá)載體，在大腸埃希氏菌中表達(dá)去核定位信號(hào)的ORF2，純化制備多抗，檢測(cè)蠶血中的核衣殼蛋白表達(dá)，家蠶血中可以檢測(cè)到大量特異的PCV2衣殼蛋白。