青海省四縣牦牛牛病毒性腹瀉的血清學(xué)分析

張忠輝，高閃電，儲(chǔ)岳峰，田占成，獨(dú)軍政，李有全，關(guān)貴全，羅建勛*，殷 宏,2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046； 2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

牛病毒性腹瀉/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起的牛傳染性疾病，以發(fā)熱、腹瀉、消化道潰瘍、流產(chǎn)、死胎等癥狀為特征，呈世界性分布[1]。BVDV為單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科瘟病毒屬，與豬瘟病毒及邊界病毒同屬，根據(jù)BVDV分離株的細(xì)胞培養(yǎng)特性將其分為細(xì)胞病變(CP)和非細(xì)胞病變(NCP)兩種生物型，而根據(jù)毒株的抗原性差異或基因組差異可將毒株分為不同的基因型和亞型，包括BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3基因型以及BVDV-1a～BVDV-1w、BVDV-2a～BVDV-2d基因亞型[2-3]。BVDV-1在全球流行范圍最廣，造成牛呼吸道疾病、腸炎、胚胎感染癥狀；BVDV-2主要分布于南北美洲和亞洲國家，我國主要分布于青海、新疆、山東、河南等省區(qū)，主要導(dǎo)致血小板減少綜合征、出血性腸炎；BVDV-3主要分布于巴西、泰國、意大利、孟加拉國、印度、阿根廷、土耳其等國家，我國主要分布于山東、河南等地，可導(dǎo)致呼吸道癥狀以及流產(chǎn)[1-3,5-7]。

本研究根據(jù)年齡、性別分層抽樣，通過對(duì)來源于青海省牦牛557份血清樣品檢測(cè)BVDV抗體評(píng)估群體流行率，并利用RT-PCR擴(kuò)增病毒5′-UTR進(jìn)行了流行株的遺傳演化分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣品 牦牛血清樣品557份，2018年采自青海省5州縣牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)未經(jīng)BVD疫苗免疫動(dòng)物，來源于海北州祁連縣(170份)和剛察縣(76份)、海南州貴南縣(200份)、海西州(10份)、西寧市大通縣(101份),用分層抽樣法選擇4縣不同年齡和性別牦牛血清232份作為試驗(yàn)用樣品。

1.1.2 主要試劑 愛德士BVDV抗體檢測(cè)試劑盒，北京世紀(jì)元亨生物科技有限公司產(chǎn)品；RNAsimple總RNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit、DH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小量提取試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；DL 2 000 DNA Marker，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；PGEM T-easy載體試劑盒，Promega公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 Eppendorf nexus GXPCR儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；DYY-12型電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；AlphaImager HP紫外凝膠成像儀，美國ProteinSimple公司產(chǎn)品；Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀，Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 血清抗體檢測(cè) 用分層抽樣的方法，根據(jù)牦牛年齡和性別，抽樣232份，用于BVDV抗體檢測(cè)。由于海西州牦牛樣本數(shù)量太少(10份)，可能對(duì)分析造成較大偏差，因此只用于后續(xù)分子檢測(cè)。參照BVDV抗體檢測(cè)試劑盒的操作說明，反應(yīng)板樣品孔中加入25 μL待檢血清，陰性對(duì)照和陽性對(duì)照各兩孔，按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行操作，最終讀取OD450 nm值。根據(jù)公式S/P=(樣品OD450-陰性平均OD450)/(陽性平均OD450-陰性平均OD450)進(jìn)行計(jì)算，當(dāng)S/P值大于0.3時(shí)判定為陽性。

1.2.2 流行率計(jì)算及分析 根據(jù)血清抗體檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)陽性率作為表觀流行率(AP)，依據(jù)試劑盒的敏感性(SE=96.30%)和特異性(SP=99.50%)，用獸醫(yī)流行病學(xué)調(diào)查與監(jiān)測(cè)抽樣計(jì)算器軟件(由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供)，以公式(TP)=(AP+SP-1)/(SE+SP-1)估計(jì)BVDV在各牦牛群體中的真實(shí)流行率[8]。用Graphpad prism5.0進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析不同群體BVDV流行率的差異。

1.2.3 RNA提取及RT-PCR 按不同采樣點(diǎn)對(duì)抽取的232份牦牛血清以及海西州10份牦牛血清進(jìn)行分組，對(duì)各組血清分別采用混樣方法檢測(cè)，即每組血清每份取100 μL，以10份/管混樣，按RNA提取試劑盒說明操作提取RNA，最終溶解于30 μL無RNAse水中備用。用牛病毒性腹瀉病毒5′-UTR保守引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增(5′-UTRF:CTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTA;5′-UTRR:CAAC TCCATGTGCCATGTACAGCA)，反應(yīng)程序?yàn)?0℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分別切較回收293 bp大小的DNA片段，連接至PGEM Teasy載體進(jìn)行序列測(cè)定，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒送蘭州天啟基因生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4 序列分析 用VecScreen、Blast、DNA Star、BioEdit等軟件對(duì)獲得序列進(jìn)行分析，分析病毒序列與GenBank中收錄參考株序列的同源性，用Mega 6生物信息學(xué)軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，參考毒株信息見表1。

表1 參考毒株序列信息

2 結(jié)果

2.1 血清抗體檢測(cè)

232份牦牛血清樣品中BVDV總體表觀流行率為82.30%，預(yù)測(cè)總體真實(shí)流行率為85.40%。各地預(yù)測(cè)牦牛BVDV真實(shí)流行率最高為海北祁連縣(99.60%)，其次為貴南縣(78.30%)和大通縣(70.90%)，而剛察縣(51.70%)較低，海北祁連縣BVD流行率顯著高于其他3個(gè)縣(P<0.05)(表2)。雄性牦牛總體BVDV預(yù)測(cè)真實(shí)流行率為90.01%，顯著高于雌性牦牛(80.70%)(P<0.05)。1歲～2歲雄性牦牛與雌性牦牛BVDV流行率未見差異，而在2歲～3歲齡、3歲～4歲齡、4歲齡以上雄性牦牛BVDV流行率均顯著高于雌性牦牛(P<0.05)(表3)。

表2 各地牦牛BVDV抗體檢測(cè)結(jié)果

表3 不同年齡和性別牦牛BVDV抗體統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 青海牦牛BVDV基因亞型分析

DNA測(cè)序后，經(jīng)BLAST以及序列比對(duì)，去除相同序列，共獲得22條不同的DNA序列。用Mega 6軟件構(gòu)建牦牛BVDV系統(tǒng)進(jìn)化樹，在青海牦牛流行BVDV可分為4個(gè)基因亞型，包括BVDV-1a(大通縣)、BVDV-1m(大通縣、貴南縣、剛察縣、海西州、祁連縣)、BVDV-1q(貴南縣、祁連縣)，BVDV-2a(貴南縣)(圖1)。牦牛BVDV-2a株與我國早期流行新疆株XJ04、SH-28的5′-UTR核苷酸一致性為95.9%～97.1%，相似性較高。BVDV-1m檢出率為54.1%，不同株間5′-UTR核苷酸一致性為95.1%～99.5%，其中在大通、貴南、海西、剛察等地毒株與牛源SD15株親緣關(guān)系較近，而祁連牦牛BVDV親緣關(guān)系與遼寧株或西昌牛源株親緣關(guān)系較近。BVDV-1q亞型檢出率與BVDV-1m相當(dāng)?shù)觊g5′-UTR核苷酸一致性略低(88.9%～99.5%)，且該亞型株5′-UTR與早期分離株SD0803相似性(89.8%～98.5%)略高于西北雙峰駝camel-6或牛源GS-3 株(89.3%～91.6%)。

3 討論

BVDV除感染牛外，還可感染牦牛、羊、豬、鹿等家畜和多種野生偶蹄動(dòng)物[9]。雖不同年齡的牛對(duì)BVDV均有易感性，但年齡、性別、經(jīng)產(chǎn)等因素使BVDV有流行差異[10-11]。本研究對(duì)青海省4地牦牛樣品利用分層抽樣的方法，進(jìn)行BVDV抗體流行病學(xué)調(diào)查，依據(jù)商品試劑盒的檢測(cè)敏感性(96.3%)對(duì)測(cè)定的表觀流行率進(jìn)行校正以預(yù)測(cè)真實(shí)流行率，相對(duì)準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)牦牛BVDV的流行程度。與文獻(xiàn)[12]相比，本研究發(fā)現(xiàn)BVDV在牦牛中的總體陽性率略高，表明在現(xiàn)有生產(chǎn)模式下牦牛群體實(shí)現(xiàn)BVDV自我凈化存在難度。

牦牛群體BVDV流行表現(xiàn)為2歲以內(nèi)抗體陽性率較低，可能與在未成年階段母源抗體的保護(hù)有關(guān)。通過感染孕畜并在新生牛形成持續(xù)感染，犢牛在6月齡～24月齡發(fā)生致死性黏膜病，因此未成年牦牛雖表現(xiàn)較低BVDV感染率但發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不應(yīng)忽視。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在2歲齡以上成年牦牛的各年齡階段，雄性群體的BVDV流行率均高于雌性群體，是否雄性成年牦牛存在較高的BVDV易感性，還需進(jìn)一步研究。

圖1 牦牛BVDV系統(tǒng)進(jìn)化樹

在我國，BVDV流行株主要有BVDV-1a～1d、BVDV-1m～1q、BVDV-1u～BVDV-1w、BVDV-2a～2b等亞型[2-4]。河南省、山東省相繼報(bào)道山羊、綿羊以及肉牛因BVDV-3自然感染發(fā)病[6-7]。本研究在牦牛中未檢出BVDV-3，可能與目前該亞型毒株在國內(nèi)流行區(qū)域比較局限有關(guān)。與文獻(xiàn)[12]相比，牦牛群體中除BVDV-1q亞型，還存在BVDV-1m作為主導(dǎo)亞型流行。在青海省牦牛占比可達(dá)90%，遠(yuǎn)高于奶牛數(shù)量，本研究發(fā)現(xiàn)1q株5′-UTR與我國西北地區(qū)奶牛分離株的相似性略低于豬源SD0803株，因此存在局限于牦牛群體內(nèi)的BVDV演化的可能。

本研究通抗體檢測(cè)和病毒基因序列分析，揭示了青海不同地區(qū)牦牛群體流行BVDV現(xiàn)狀，豐富了青海省牦牛BVDV的基因亞型信息，可為牦牛BVDV防控提供科學(xué)依據(jù)。