冷凍雞肉中單核細(xì)胞增生李斯特菌2個(gè)分離株的毒力及毒力相關(guān)因素研究

李 楠，阮婷玉，孫天浩，康立超，彭 健，王 靜*，馬 勛*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測試中心，新疆石河子 832003)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)簡稱單增李斯特菌，是一種重要的食源性胞內(nèi)病原體，由其引起的疾病能夠侵害多種家畜、野生動(dòng)物和人類，屬自然疫源性人獸共患病。17多種禽類(如雞、火雞、鴿子和水禽等)對LM敏感[1]，LM感染禽類后通常導(dǎo)致腸、脾、肝、腎、心臟、肺和氣囊局部壞死[2]。LM耐受低溫環(huán)境，常污染冷藏、冷凍食品[3]。評估宿主與LM病原體相互作用的體外和體內(nèi)模型有很多，包括組織培養(yǎng)、小鼠、豚鼠、秀麗隱桿線蟲[4]、果蠅和斑馬魚等。雞胚已經(jīng)被用來確定許多不同微生物的感染能力，包括細(xì)菌、真菌、寄生蟲和病毒[5]。本文以2株冷凍雞肉中分離的LM為研究對象，以雞胚作為感染模型，對分離株的毒力及其相關(guān)致病因素的差異進(jìn)行研究，以期為實(shí)驗(yàn)易感動(dòng)物的擴(kuò)展、食源性LM的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2株冷凍雞肉來源的LM分離株，編號為LM873和LM925，無害李斯特菌(L.innocua)，均由石河子大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；雞胚由烏蘇市鑫湖養(yǎng)雞農(nóng)民專業(yè)合作社提供。

1.1.2 主要試劑及引物 腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、10 g/L亞碲酸鉀溶液，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；2×PCR Mix，廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；結(jié)晶紫，索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；草酸銨，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司產(chǎn)品；NaCl，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。引物參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)8對引物(表1)，由北京華大基因公司合成。

1.1.3 主要儀器 細(xì)菌振蕩培養(yǎng)箱(IS-RDV 1)，蘇州捷美電子有限公司產(chǎn)品；普通PCR儀(ArKtiK)，德國Thermo公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機(jī)(LabCYCIeV)，美國Bio-Rad產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(POWER WAVE XS)，美國BIOTEK公司產(chǎn)品；電泳儀(CS-500V)，英國Cleaver公司產(chǎn)品；孵化機(jī)，大江電子有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雞胚毒力測定 將雞胚在37.9℃、53%濕度條件下孵育至14日齡，將LM873、LM925和L.innocua搖菌至對數(shù)生長期，然后進(jìn)行菌量測定，將0.1 mL倍比稀釋的細(xì)菌經(jīng)絨毛尿囊膜接種雞胚，對照組注入0.1 mL PBS，每組5枚雞胚。接種后繼續(xù)在相同條件下孵育，每天監(jiān)測胚胎死亡情況至20日齡，用改良寇氏法計(jì)算菌的50%致死量(LD50)。計(jì)算公式：LD50=log-1[Xm-i(∑P-0.5)]，其中：Xm為接種的最大劑量的對數(shù)；P為各組動(dòng)物的死亡率；∑P為各組動(dòng)物死亡率總和；i為組間距。

表1 本試驗(yàn)所用PCR引物

1.2.2 雞胚肝臟指數(shù)測定 及時(shí)取出死亡雞胚并剖檢，觀察其肝臟變化，稱重雞胚與肝臟，計(jì)算肝臟指數(shù)。對未死亡雞胚在20日齡時(shí)剖檢，操作同上。

1.2.3 毒力基因PCR檢測 將LM873、LM925和L.innocua搖菌至對數(shù)生長期，收集菌液于-20℃保存?zhèn)溆?。通過PCR擴(kuò)增上述8個(gè)毒力基因，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定分離株有無毒力基因。 PCR擴(kuò)增體系:2×PCR mix 12.5 μL，lmo0833、lmo2672、lmo1188、lmo1134、lmo0834、lmo2470、lmo1116和lmo2821基因的上、下游引物(25 μmol/L)各0.5 μL，菌液2 μL，剩余用超純水補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 2 min；94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 2 min。

1.2.4 溶血活性測定方法 采集健康綿羊全血，制備成10 mL/L綿羊紅細(xì)胞懸液。將菌液離心后取上清液，用PBS緩沖液調(diào)OD600nm值至相同大小，加入96孔板，加入等體積的10 mL/L綿羊紅細(xì)胞懸液37℃作用2 h，并以PBS緩沖液作為空白對照，將能產(chǎn)生50%溶血的最高稀釋倍數(shù)表示為溶血價(jià)。

1.2.5 生物被膜形成能力的測定 將3株菌分別培養(yǎng)，每孔加入180 μLBHI和20 μL培養(yǎng)菌液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，至每孔OD600nm值≈0.4～0.6，8個(gè)平行重復(fù)，37℃條件下靜置培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、24、36、48 h，吸去孔中的培養(yǎng)物，PBS洗滌3～5次，采用結(jié)晶紫染色法[7]，每孔加100 μL 10 g/L結(jié)晶紫染色20 min，棄染液，PBS洗滌3～5次，倒置顯微鏡下觀察不同時(shí)期生物被膜的形成狀態(tài)。每孔加入950 mL/L乙醇脫色30 min，測定OD600nm值。

2 結(jié)果

2.1 冷凍雞肉LM分離株雞胚毒力測定結(jié)果

將不同濃度菌液經(jīng)絨毛尿囊膜接種于14日齡雞胚，連續(xù)觀察和記錄至21日齡，發(fā)現(xiàn)L.innocua組和PBS對照組對雞胚無致死性，其他分離株均有致死性，其中接種LM925的雞胚在16日齡開始死亡，死亡時(shí)間集中在16日齡～18日齡，接種LM873的雞胚在17日齡開始出現(xiàn)死亡情況死亡集中在17日齡～20日齡，2株菌對雞胚的致死率存在差異，用改良寇氏計(jì)算法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，LM925的LD50為1.533，LM873的LD50為4.733，相差3.2個(gè)數(shù)量級(表2)。

2.2 雞胚肝臟指數(shù)

雞胚解剖稱重發(fā)現(xiàn)，攻毒雞胚的肝臟指數(shù)高于PBS和L.innocua組，差異顯著(P<0.05)，但2個(gè)分離株之間以及L.innocua和PBS之間無顯著差異(表3)。

2.3 毒力基因檢測

3株菌毒力基因檢測結(jié)果顯示，8個(gè)毒力基因均不存在于L.innocua中，lmo1116基因只存在于LM925中，除此之外其余7個(gè)毒力基因LM873和LM925均含有(圖1)。

2.4 分離菌株溶血活性的測定結(jié)果

溶血活性結(jié)果顯示L.innocua不溶血，LM925溶血價(jià)為24，LM873溶血價(jià)為23(圖2)，LM925的溶血能力比LM873高2倍。

表2 LM分離株接種雞胚半數(shù)致死量(LD50)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表3 雞胚肝臟指數(shù)測定結(jié)果

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000 ；1.LM873；2.LM925；3.L.innocua；4.空白

2.5 生物被膜形成能力的測定

結(jié)晶紫染色法檢測LM925、LM873和L.innocua的生物被膜形成能力。結(jié)果顯示，6 h開始出現(xiàn)疏松的結(jié)構(gòu)；8、10、12、24h時(shí)，逐漸形成明顯有序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，36 h生物被膜的結(jié)構(gòu)最明顯，且密集程度最高，其中LM925的生物被膜最致密也最完整；48 h時(shí)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)開始瓦解，LM925還可見到松散的網(wǎng)格，而LM873和L.innocua的生物被膜已經(jīng)完全消失(圖3)。

生物被膜形成不同時(shí)間點(diǎn)OD600nm測定結(jié)果顯示，6、8、10、12、24、36 h時(shí)，LM925與LM873相比，生物被膜的形成均差異顯著(P<0.05)，且在10、24、36 h時(shí)，LM925較LM873的差異極顯著(P<0.01)，48 h時(shí)，LM925與LM873無顯著差異(P>0.05)，而LM873與L.innocua僅在24 h時(shí)差異顯著(P<0.05)(圖4)。

3 討論

由于LM在肉類食品中污染廣泛，危害性大，因此，加強(qiáng)對LM的檢測很重要。有研究對LM無毒株和強(qiáng)毒株的比較，篩選得到僅存在于強(qiáng)毒株的lmo0833、lmo0834和lmo1188基因。又通過比較EGD-e和L.innocua的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和內(nèi)化素篩選出lmo1116、lmo2672和lmo1134等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因，lmo2470和lmo2821等內(nèi)化蛋白[6]。發(fā)現(xiàn)這8個(gè)毒力基因與L.innocua均無同源序列，小鼠毒力測定和大量細(xì)菌菌株P(guān)CR檢測，結(jié)果顯示這8個(gè)毒力基因可區(qū)分有毒和無毒LM分離株。本試驗(yàn)對這8個(gè)毒力基因的檢測顯示，L.innocua中不含8個(gè)毒力基因，LM925比LM873多1個(gè)lmo1116，而lmo1116是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，可能調(diào)控了其他毒力基因的表達(dá)。本試驗(yàn)LM925的溶血活性強(qiáng)于LM873。單增李斯特菌溶血素O(listeriolysin O，LLO)作為LM致病最重要的毒力因子之一[8]，LM能夠利用進(jìn)入宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)躲避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊、攝取營養(yǎng)并增殖，這一過程很大程度上依賴LLO[9]，雞胚模型中LLO在LM導(dǎo)致雞胚死亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[2]。2株冷凍雞肉LM分離株的毒力差異較大，其中LM925的LD50結(jié)果比LM873高3.2個(gè)數(shù)量級。綜合毒力基因和溶血活性結(jié)果，確定LM925與LM873為有毒株，雖然LM925生物被膜的形成能力強(qiáng)于LM873，但LM873與L.innocua卻無明顯差異。結(jié)果推測2株冷凍雞肉分離株毒力差異與溶血素活性和lmo1116基因有關(guān)。

圖2 LM873、LM925與L.innocua溶血價(jià)測定結(jié)果

圖3 不同時(shí)間段生物被膜的觀察結(jié)果

*P<0.05；**P<0.01圖4 LM生物被膜形成能力測定結(jié)果

生物被膜是附著于物體表面的微生物群落，能夠保護(hù)內(nèi)部細(xì)菌免受免疫系統(tǒng)和抗菌藥物的作用[10]，生物被膜也易導(dǎo)致食品的持續(xù)污染。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LM925與LM873均具有形成生物被膜的能力，6 h有少量微菌落的形成，8 h開始生物被膜逐漸形成，36 h形成最致密、完整的生物被膜，48 h開始分散。由于生物被膜對消毒劑、低溫等不利環(huán)境耐受性強(qiáng)，食品源LM一旦生成生物被膜，對食品安全的危害將更大。本試驗(yàn)以雞胚作為感染模型，發(fā)現(xiàn)雞胚對LM敏感，是LM感染的理想模型，而毒力相關(guān)因素分析表明2株菌為強(qiáng)毒株，且LM的毒力主要與溶血素活性和lmo1116相關(guān)。冷凍雞肉LM分離株具有生物被膜形成能力，同時(shí)能致雞胚死亡，提示養(yǎng)禽業(yè)與食品業(yè)應(yīng)加大對LM的管控力度。