豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白與熱休克蛋白DNAJC7的相互作用研究

呂其壯，黃 婷，雷小曉，王 濤，陳旭健*，盧成淑*

(1.玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，廣西玉林 537000；2.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西玉林 537000； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus type，PCV)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，是已發(fā)現(xiàn)的最小動(dòng)物病毒之一，已經(jīng)確定有PCV1、PCV2、PCV3和PCV4共4種基因型[1]。PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-wearingmultisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原體，感染豬后通過(guò)病毒復(fù)制和誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡而觸發(fā)免疫抑制，進(jìn)一步降低機(jī)體對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)性，增加了豬只對(duì)其他病原體的易感性，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。PCV2共含有11個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading flame，ORF)，其中OPR2所編碼的核衣殼Cap蛋白是PCV2病毒粒子唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，分子質(zhì)量約27.8 ku，全長(zhǎng)234個(gè)氨基酸，具有良好的免疫原性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫[3]。由于PCV2本身不具備復(fù)制關(guān)鍵酶，需在宿主蛋白酶幫助下完成自我復(fù)制，因此在PCV2感染機(jī)體過(guò)程中，需要病毒核酸及其所編碼的相關(guān)蛋白與宿主蛋白相互作用來(lái)完成病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制和擴(kuò)增，因此進(jìn)一步探究宿主細(xì)胞與Cap蛋白的相互作用是非常必要的。

熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsp)作為分子伴侶廣泛存在于迄今為止發(fā)現(xiàn)的所有生物中，在多種病毒增殖的不同階段與病毒蛋白形成Hsp-病毒肽復(fù)合物而協(xié)助病毒蛋白的正確折疊、裝配、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、成熟及釋放，在宿主天然免疫和獲得性免疫中不可或缺[4]。DNAJC7是DnaJ/Hsp40熱休克蛋白家族的成員之一，不僅能夠獨(dú)立發(fā)揮分子伴侶的功能，而且可以顯著提升Hsp70、Hsp60、Hsp90等在宿主細(xì)胞內(nèi)的生理生化調(diào)節(jié)能力。有研究發(fā)現(xiàn)在PCV2感染過(guò)程中Hsp70與Cap蛋白相互作用，并且對(duì)PCV2感染周期具有明顯的影響[5]。與此同時(shí)，過(guò)表達(dá)Hsp27能使PCV2復(fù)制量升高；在PK-15細(xì)胞中培養(yǎng)PCV2時(shí)，過(guò)表達(dá)Hsp90也能顯著提升PCV2復(fù)制量[6-7]。既然Hsp90、Hsp70、Hsp60和Hsp27等幾種熱休克蛋白均已被證實(shí)在PCV2感染后的細(xì)胞中水平升高[8-9]，而DNAJC7又是上述熱休克蛋白的輔助分子伴侶，因此推測(cè)DNAJC7也極有可能參與對(duì)PCV2復(fù)制過(guò)程的影響，而且這種影響很可能是通過(guò)DNAJC7與Cap蛋白之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但至今尚無(wú)DNAJC7與PCV2病毒相互作用的報(bào)道。

本研究利用構(gòu)建的豬熱休克蛋白DNAJC7基因和PCV2ORF2基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞并采用雙向免疫共沉淀試驗(yàn)(Co-IP)檢測(cè)，結(jié)果表明PCV2 Cap蛋白與豬DNAJC7蛋白之間存在相互作用，為進(jìn)一步揭示熱休克蛋白在PCV2感染宿主過(guò)程中所發(fā)揮的重要作用及其機(jī)制提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、載體 豬肺泡巨噬細(xì)胞系和sf9細(xì)胞均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院張彥明教授惠贈(zèng)[10]。pFast-bac1-CAX71050.1(pFast)購(gòu)自鐘鼎生物技術(shù)公司；pFast-GST真核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室基于pFast改造構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 DNA凝膠純化試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒，AXYGEN公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑(脂質(zhì)體2000)、培養(yǎng)基(SF 900 Ⅱ)和胎牛血清，Invitrogen公司產(chǎn)品；Protein G Sepharose，Procell Gene公司產(chǎn)品；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和Western及IP細(xì)胞裂解液，海門(mén)碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；PVDF膜，Millipore公司產(chǎn)品；兔抗Cap多克隆抗體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所尹雙輝副研究員惠贈(zèng)；兔抗豬DNAJC7多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存[11]；兔抗GAPDH單克隆抗體(MAb)，Abcam公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，天津三箭生物科技有限公司產(chǎn)品；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，Pierce公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 1 μL～1000 μL微量移液器，德國(guó)艾本德(Eppendorf)股份有限公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀、蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)伯樂(lè)(Bio-Rad)公司產(chǎn)品；核酸電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；紫外凝膠成相系統(tǒng)，英國(guó)Syngene公司產(chǎn)品；Tanon 5200 Multi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；Ti-E倒置熒光顯微鏡，日本尼康(Nikon)公司產(chǎn)品；核酸濃度檢測(cè)儀和-80℃超低溫冰箱，美國(guó)賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組桿狀病毒質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)豬DNAJC7基因(XM-003131409.5)序列，利用軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物(DNAJC7-F：5′-CGCGGATCCATGGCGGCTGCCGCGGAGT GCG-3′/DNAJC7-R：5′-CCCAAGCTTTTAGCCA AACTGGAAAAAG-3′)，并在上下游分別添加BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，送交北京六合華大基因公司合成。此外，根據(jù)PCV2ORF2基因(AY188355)序列，采用基于PAS(PCR-based accurate synthesis)的方法直接合成PCV2ORF2基因并在其N(xiāo)端插入GST標(biāo)簽，在其N(xiāo)端和C端分別添加BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。提取豬肺泡巨噬細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板，采用引物DNAJC7-F/DNAJC7-R，擴(kuò)增豬DNAJC7基因片段。載體pFast經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，分別與上述擴(kuò)增的Cap和DNAJC7基因片段同源重組構(gòu)建pFast-GST-Cap和pFast- DNAJC7真核表達(dá)質(zhì)粒，并通過(guò)菌落PCR和測(cè)序進(jìn)一步鑒定。

1.2.2 重組蛋白GST-Cap和豬DNAJC7蛋白表達(dá)的Western blot鑒定 采用脂質(zhì)體2000按每種質(zhì)粒各1 μg將pFast-GST-Cap和pFast-DNAJC7分別轉(zhuǎn)染至6孔板中密度為70%～80%的sf9細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染pFast作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，向每孔加入Western及IP細(xì)胞裂解液200 μL，孵育30 min后離心，收集細(xì)胞裂解上清液。將細(xì)胞裂解上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，分別用兔抗Cap多克隆抗體(1∶300)和兔抗DNAJC7多克隆抗體(1∶500)作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG MAb(1∶5 000)作為二抗，經(jīng)Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。

1.2.3 DNAJC7與Cap相互作用的雙向免疫共沉淀(Co-IP)試驗(yàn) 用1.2.2方法將pFast-GST-Cap+pFast-DNAJC7共轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染pFast-GST-Cap+pFast和pFast-DNAJC7+pFast-GST作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，按1.3中方法裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞裂解上清液。取30 μL Protein G置于磁力架上，PBS洗滌4次，加入100 μL細(xì)胞裂解上清液后于4℃條件下旋浮4 h，留上清去沉淀。再各取30 μL Protein G置于磁力架上，PBS洗滌4次后，分別加入15 μg兔抗Cap多克隆抗體(1∶300)(反向Co-IP時(shí)，此處加入15 μg兔抗DNAJC7多克隆抗體(1∶500))和15 μg 羊抗兔IgG MAb(1∶5 000)，4℃旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)4 h，去上清留沉淀。將第1次所得上清加入第2次所得沉淀中，4℃旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)12 h，去上清，沉淀用PBST洗4次后用50 μL洗脫液重懸，輕輕混勻，4℃旋轉(zhuǎn)30 min，留上清去沉淀。用中和液調(diào)節(jié)上清pH至7.5，取中和后上清40 μL，加入10 μL 5×上樣緩沖液，煮沸10 min，離心收集上清，作為Co-IP樣品。將細(xì)胞裂解上清液和Co-IP樣品按1.2.2中的方法進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 重組桿狀病毒質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

昆蟲(chóng)細(xì)胞-重組桿狀病毒系統(tǒng)作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，能夠高效率地產(chǎn)生可溶形式的重組蛋白，并且基本保持蛋白的原有活性[12]，考慮到PCV2 Cap多以包涵體形式表達(dá)，因此為了盡可能使Cap蛋白能夠以可溶性形式表達(dá)，本研究采用昆蟲(chóng)細(xì)胞-重組桿狀病毒系統(tǒng)來(lái)表達(dá)Cap蛋白并在其N(xiāo)端添加促溶標(biāo)簽蛋白GST。利用載體pFast上下游通用引物經(jīng)菌落PCR對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pFast-GST-Cap經(jīng)PCR擴(kuò)增出現(xiàn)大小約為2 900 bp的單一目的條帶(圖1A)；pFast-DNAJC7經(jīng)PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)大小約3 000 bp的單一條帶(圖1B)，均與預(yù)期相符，并且測(cè)序結(jié)果顯示基因序列完全正確，表明重組桿狀病毒質(zhì)粒pFast-GST-Cap和pFast-DNAJC7正確構(gòu)建。

A.重組質(zhì)粒pFast-GST-Cap 菌落PCR驗(yàn)證; M.DNA標(biāo)準(zhǔn)；1.重組質(zhì)粒pFast-GST-Cap的菌落PCR結(jié)果; B.重組質(zhì)粒pFast-DNAJC7菌落PCR驗(yàn)證; M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對(duì)照；2.重組質(zhì)粒pFast-DNAJC7的菌落PCR結(jié)果

2.2 重組蛋白GST-Cap和豬DNAJC7蛋白表達(dá)的鑒定結(jié)果

將pFast-GST-Cap和pFast-DNAJC7分別轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，同時(shí)用pFast轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞作為對(duì)照，利用Western blot檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，在細(xì)胞裂解上清液中，分別在56 ku(圖2A)和58 ku(圖2B)處有特異性條帶，表明重組質(zhì)粒pFast-GST-Cap和pFast-DNAJC7轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后重組蛋白GST-Cap和豬DNAJC7蛋白均得到良好表達(dá)。

A.重組蛋白GST-Cap的Western blot檢測(cè); M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1.轉(zhuǎn)染pFast-GST-Cap的sf9細(xì)胞裂解上清液；2.轉(zhuǎn)染pFast的sf9細(xì)胞裂解上清液; B.豬DNAJC7蛋白Western blot檢測(cè); M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.轉(zhuǎn)染pFast-DNAJC7的sf9細(xì)胞裂解上清液；2.轉(zhuǎn)染pFast的sf9細(xì)胞裂解上清液

2.3 DNAJC7與Cap相互作用的雙向Co-IP驗(yàn)證結(jié)果

將pFast-GST-Cap和pFast-DNAJC7共轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)用pFast-GST-Cap+pFast和pFast-DNAJC7+pFast-GST分別共轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞作為對(duì)照，利用雙向Co-IP試驗(yàn)檢測(cè)DNAJC7蛋白與Cap蛋白的相互作用。結(jié)果顯示，利用 Protein G沉淀Cap蛋白后用兔抗DNAJC7多克隆抗體檢測(cè)Co-IP樣品時(shí)，發(fā)現(xiàn)pFast-GST-Cap和pFast-DNAJC7共轉(zhuǎn)后的樣品中能夠檢測(cè)到DNAJC7蛋白，而pFast-GST-Cap和pFast以及pFast-DNAJC7和pFast-GST共轉(zhuǎn)后的樣品中均未檢測(cè)到DNAJC7蛋白的存在(圖3A和3C)；利用Protein G沉淀DNAJC7蛋白后用兔抗Cap多克隆抗體檢測(cè)Co-IP樣品時(shí)，發(fā)現(xiàn)pFast-GST-Cap和pFast-DNAJC7共轉(zhuǎn)后的樣品中能夠檢測(cè)到Cap蛋白，而pFast-GST-Cap和pFast以及pFast-DNAJC7和pFast-GST共轉(zhuǎn)后的樣品中均未檢測(cè)到Cap蛋白的存在(圖3B和3C)。以上結(jié)果表明DNAJC7蛋白與Cap蛋白存在特異的相互作用。

A.用兔抗Cap多克隆抗體做的IP檢測(cè); B.用兔抗DNAJC7多克隆抗體做的IP檢測(cè); C.Input對(duì)照

3 討論

病毒為逃避宿主的天然免疫應(yīng)答，會(huì)編碼多種病毒蛋白與宿主Hsp40蛋白互作，以此拆卸Hsp40-p58IPK復(fù)合體而釋放出游離狀態(tài)的p58IPK蛋白，從而實(shí)現(xiàn)病毒對(duì)宿主PKR通路的抑制以保證病毒自身的復(fù)制與增殖。如流感病毒就是通過(guò)其核蛋白NP與宿主Hsp40互作而促使Hsp40從Hsp40-p58IPK復(fù)合體中解離，釋放出P58IPK以拮抗PKR效應(yīng)[13]。考慮到PCV2 Cap蛋白能夠與豬DNAJC7蛋白相互作用，而DNAJC7蛋白又是Hsp40蛋白的一種，因此推測(cè)PCV2病毒也極有可能通過(guò)其Cap蛋白與Hsp40蛋白相互作用而拆卸Hsp40-p58IPK復(fù)合體，從而有助于實(shí)現(xiàn)自己的免疫逃逸，但具體情況有待進(jìn)一步研究證實(shí)。豬DNAJC7蛋白與PCV2 Cap蛋白之間的這種互作也極有可能促進(jìn)PCV2 Cap蛋白的胞內(nèi)降解過(guò)程，因?yàn)槠渌嚓P(guān)研究已經(jīng)表明Cap蛋白在PCV感染過(guò)程中有可能是被宿主蛋白酶體介導(dǎo)的泛素化所降解，有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Cap與泛素家族的MKRN1共沉淀和共定位[14]，更為巧合的是，早先便已證實(shí)Hsp40蛋白可通過(guò)促進(jìn)人體α-synuclein的泛素化降解而抑制帕金森綜合征(PD)的發(fā)生和發(fā)展[15]。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究豬DNAJC7蛋白與PCV2 Cap蛋白相互作用機(jī)制及其對(duì)PCV2復(fù)制的影響奠定了基礎(chǔ)，完善了PCV2 Cap蛋白與宿主蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)，但由于該試驗(yàn)是在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行的，而昆蟲(chóng)細(xì)胞并不是PCV2的靶細(xì)胞，因此未來(lái)需要在PCV2感染靶細(xì)胞(如豬肺泡巨噬細(xì)胞)中進(jìn)一步研究證實(shí)。