豬流行性腹瀉病毒COE蛋白的原核表達(dá)及免疫原性分析

李雅心，郭 濤，胡瑞瑞，王小奎，米桃桃，倪 偉，胡圣偉

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是引起豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)的病原體，PED以仔豬發(fā)熱、消化道黏膜發(fā)炎、劇烈腹瀉、嘔吐、嚴(yán)重脫水等為特征，易引起空腸和回腸內(nèi)絨毛破壞及萎縮[1]，是目前嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的傳染性疾病之一。PEDV侵襲世界各地豬群，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。與經(jīng)典株及疫苗株的基因序列相比，全球PEDV流行株發(fā)生了很大程度的變異，其S基因序列與2010年前的毒株及經(jīng)典疫苗株的同源性?xún)H為93.3%～95.7%和93.8%～93.9%[3]。由此可見(jiàn)，用經(jīng)典毒株制備的PED弱毒疫苗可能對(duì)新的PEDV變異毒株感染無(wú)完全保護(hù)力[4]。選擇當(dāng)前流行株制備PED疫苗成為防控PED發(fā)生的關(guān)鍵。本研究通過(guò)分析2010年后國(guó)內(nèi)PEDV流行毒株COE區(qū)氨基酸序列，得到COE區(qū)相對(duì)保守序列，用pET-32a原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)COE融合蛋白，并進(jìn)行目的蛋白的免疫原性分析，為后續(xù)PED亞單位疫苗的研制及抗體檢測(cè)方法的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、載體和試驗(yàn)用動(dòng)物 感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α、TransB(DE3)，原核表達(dá)載體pET-32a(+)均為石河子大學(xué)動(dòng)物基因工程實(shí)驗(yàn)室保存；3月齡外三元豬購(gòu)自新疆石河子市某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 限制性?xún)?nèi)切酶EcoR、XhoⅠ和SolutionⅠ，TaKaRa公司產(chǎn)品；Protein Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；酵母提取物和胰蛋白胨，OXOID公司產(chǎn)品；His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱HisTrapTMFF Crude，美國(guó)GE公司產(chǎn)品；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和羊抗豬IgG-HRP抗體，北京Solarbio科技有限公司產(chǎn)品；基因合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.3 主要儀器 微量移液器和PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品；電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；普通細(xì)菌搖床，廣州艾卡儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PEDV S蛋白COE基因設(shè)計(jì)與合成 用生物學(xué)軟件DNAman 7.0對(duì)自2010年以后國(guó)內(nèi)PEDV流行株COE(499aa-638aa)氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，選取相對(duì)保守毒株(GenBank登錄號(hào)：KU237224)，根據(jù)大腸埃希氏菌對(duì)密碼子的偏好性?xún)?yōu)化稀有密碼子，交由上海生工生物工程有限公司合成編碼CEO區(qū)的基因片段，并插入到pET-28a(+)質(zhì)粒中，5′末端引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和起始密碼子ATG，3′末端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒命名為pET-28a-COE。

1.2.2 COE區(qū)生物信息學(xué)分析 COE蛋白的理化性質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)由ProtParam、ProtScale等生物信息分析工具進(jìn)行預(yù)測(cè)分析(表1)。

表1 生物信息分析工具

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 提取pET-28a-COE質(zhì)粒與pET-32a(+)質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ在37℃條件下酶切2 h，酶切體系(總體積為20 μL)：2 μL 10×Q buffer，1 μLEcoRⅠ，1 μLXhoⅠ，6 μL pET-28a-COE(pET-32a(+))，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。酶切產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收。將回收的COE基因片段和pET-32a(+)載體在16℃連接4 h，連接體系(總體積為10 μL)：5 μL Solution Ⅰ，2.5 μLCOE，2.5 μL pET-32a(+)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取單菌落，接種于10 mL LB培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)后小提質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，將初步鑒定正確的質(zhì)粒所對(duì)應(yīng)的克隆菌株交由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-COE。

1.2.4 重組COE蛋白的原核表達(dá)與純化 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-32a-COE轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌TransB(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有Amp的LB平板過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后小提質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組菌株命名為pET-32a-COE-TransB(DE3)。取鑒定正確的陽(yáng)性菌株于37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)進(jìn)行活化，次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至50 mL含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃、180 r/min培養(yǎng)至菌液OD600 nm值為0.4～0.6時(shí)，添加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)8 h后，8 000 r/min離心5 min收集菌體。加入裂解緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 7.4)，重懸菌體并于4℃過(guò)夜裂解，次日反復(fù)凍融3次后，冰水狀態(tài)下超聲破碎，超聲5 s，間隔5 s，破碎至液體澄清。12 000 r/min離心30 min，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE(12%)分析重組COE蛋白的表達(dá)形式。采用GE公司His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱HisTrapTMFF Crude純化蛋白，經(jīng)過(guò)透析和濃縮處理后，利用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定純化的COE蛋白濃度，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 動(dòng)物分組及免疫 挑選體重相近的3月齡外三元豬4頭，隨機(jī)分為2組，COE蛋白免疫組(P1、P2)和PBS免疫對(duì)照組(D1、D2)。蛋白經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后，與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后于豬頸部皮下多點(diǎn)注射免疫，免疫劑量為1 mg/頭，PBS免疫對(duì)照組以同樣方式注射等體積PBS溶液。免疫前及免疫后第14、21、28、35、42天于前腔靜脈采血3 mL，分離血清置-20℃保存。

1.2.6 ELISA檢測(cè)血清IgG抗體水平 以純化的重組COE蛋白為抗原，每孔加入100 μL(0.5 μg/L)包被ELISA板，4℃孵育過(guò)夜，次日棄去孔內(nèi)液體，PBS′T洗滌3次，每孔加入200 μL封閉液(含50 g/L BSA的PBS′T)，37℃孵育2 h后洗滌3次，每孔加入100 μL經(jīng)8 000倍稀釋的血清，37℃孵育1 h后洗滌5次，每孔加入100 μL經(jīng)2 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG，37℃孵育1 h后洗滌5次。每孔加入100 μL TMB底物緩沖液，37℃避光孵育15 min，每孔再加入50 μL終止液。在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。評(píng)價(jià)COE蛋白免疫原性標(biāo)準(zhǔn)為免疫后血清樣品OD450(P)/免疫前血清樣品OD450 nm值(N)≥2且免疫前血清樣品OD450 nm值<1[5]。

2 結(jié)果

2.1 PEDV編碼S蛋白COE區(qū)基因的合成

參考GenBank中的PEDV S蛋白氨基酸序列，選擇499-638aa片段序列，優(yōu)化稀有密碼子后進(jìn)行全基因合成(圖1) 。

2.2 COE區(qū)生物信息學(xué)分析

COE基因編碼的蛋白含有140個(gè)氨基酸，分子式為C686H1022N164O215S4，分子質(zhì)量約15 ku，等電點(diǎn)理論值為4.78。運(yùn)用ExPASy protparam計(jì)算得出平均疏水指數(shù)為0.111，預(yù)測(cè)該蛋白是疏水性蛋白。利用SignalP-3.0中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(Neural Network，NN)進(jìn)行信號(hào)肽分析，結(jié)果表明COE蛋白無(wú)信號(hào)肽序列。經(jīng)SOPMA預(yù)測(cè)COE蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示COE蛋白含有5% α螺旋，2.86% β轉(zhuǎn)角，45%延伸鏈和47.14%無(wú)規(guī)則卷曲。TMHMM工具分析提示COE蛋白無(wú)跨膜卷曲，屬于非跨膜蛋白。使用Abcpred軟件對(duì)該蛋白的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，將閾值設(shè)置為0.85，氨基酸長(zhǎng)度為16個(gè)，結(jié)果顯示COE蛋白的B細(xì)胞抗原表位不小于0.85的共有5個(gè)(表2)。

圖1 合成序列

2.3 pET-32a-COE表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

pET-28a-COE與pET-32a(+)質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后，成功獲得420 bp的目的基因與載體片段(圖2)。回收酶切產(chǎn)物并連接，將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證(圖3)，在420 bp處可見(jiàn)與預(yù)期相符的目的基因條帶，經(jīng)測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)與合成序列完全一致，表明pET-32a-COE載體構(gòu)建成功。

表2 B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4 重組COE蛋白的表達(dá)及純化

重組表達(dá)菌株pET-32a-COE-TransB(DE3)經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后，超聲破碎裂解菌體，離心所得上清和沉淀通過(guò)SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示沉淀樣品在預(yù)期35 ku處有目的條帶，說(shuō)明COE蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。用HisTrapTMFF Crude純化后獲得了相應(yīng)大小的一條COE蛋白條帶，且純化效果較好(圖4)。BCA法測(cè)得純化濃縮后COE蛋白的濃度為1.85 mg/mL。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.pET-28a-COE質(zhì)粒；2.pET-28a-COE質(zhì)粒酶切；3.pET-32a(+)質(zhì)粒；4.pET-32a(+)質(zhì)粒酶切

圖2 pET-28a-COE與pET-32a(+)酶切結(jié)果

2.5 血清IgG抗體水平檢測(cè)

用ELISA方法檢測(cè)COE蛋白免疫后血清COE特異性IgG抗體含量水平，結(jié)果顯示，免疫后14 d對(duì)照組OD450 nm值無(wú)明顯變化，而COE蛋白免疫組OD450 nm值均顯著升高(P<0.01)，且P/N≥2(表3)。免疫后42 d內(nèi)抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示(圖5)，COE蛋白免疫組與對(duì)照組相比，抗體水平明顯增加，表明COE重組蛋白免疫豬能夠刺激豬產(chǎn)生COE特異性IgG抗體，具有良好的免疫原性。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.Plasmid pET-32a-COE；2.EcoRⅠ/XhoⅠ

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組菌誘導(dǎo)前；2.重組菌誘導(dǎo)后；3.重組菌誘導(dǎo)后沉淀；4.純化后的COE重組蛋白

圖5 不同時(shí)間COE蛋白免疫組(P1、P2)和 PBS對(duì)照組(D1、D2)血清IgG檢測(cè)結(jié)果

3 討論

基于經(jīng)典毒株CV777和DR13制備的疫苗不能很好地對(duì)仔豬起到免疫保護(hù)作用，用變異毒株YC2014制備的滅活疫苗保護(hù)效果較好[6]。說(shuō)明PED的發(fā)生是PEDV進(jìn)化和變異為不同的基因型引起的，所以對(duì)于多樣化的PEDV毒株，傳統(tǒng)疫苗無(wú)法保護(hù)仔豬免受感染。S蛋白是影響PEDV毒力的關(guān)鍵蛋白，其遺傳變異往往造成毒株毒力的改變，但其COE區(qū)在不同基因型的PEDV毒株間相對(duì)保守[7]，因此，COE蛋白是較好的PED疫苗候選抗原。

大腸埃希氏菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清晰、表達(dá)量高、成本低、表達(dá)周期短等優(yōu)點(diǎn)，是外源病毒蛋白表達(dá)的首選表達(dá)系統(tǒng)[8]。本研究選擇可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的最小片段COE區(qū)，采用原核表達(dá)載體pET-32a(+)，成功在體外表達(dá)并純化得到了PEDV變異毒株的COE蛋白，一方面可以作為制備PEDV變異毒株亞單位疫苗的候選，另一方面可以利用表達(dá)的蛋白建立檢測(cè)PEDV抗體的方法，為預(yù)防和控制該病提供技術(shù)支撐。

用原核表達(dá)得到的PEDV相關(guān)蛋白免疫小鼠后，檢測(cè)到融合蛋白均顯示良好免疫原性[9-10]。將PEDV Brl/87株的COE基因在煙草中表達(dá)，并通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)其具有良好的抗原性[11]。表達(dá)PEDVCOE基因的重組枯草芽孢桿菌口服后可以刺激豬高水平的局部及全身免疫反應(yīng)，有可能成為對(duì)抗豬PEDV感染的候選疫苗[12]。有研究成功構(gòu)建了表達(dá)PEDV N基因和中和抗原表位COE基因的重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)[13]，用兩組重組菌分別免疫小鼠，檢測(cè)抗體水平發(fā)現(xiàn)，既可刺激小鼠產(chǎn)生高效的全身免疫反應(yīng)，還能引起局部黏膜免疫應(yīng)答，具備研發(fā)成新型口服疫苗的優(yōu)勢(shì)。

本研究用生物信息學(xué)分析工具對(duì)PEDV COE蛋白親水性、空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等綜合分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列中存在多個(gè)抗原表位，為后期篩選抗原表位區(qū)域提供了方向。通過(guò)基因工程技術(shù)，獲得純化COE蛋白，免疫豬后檢測(cè)到血清中IgG抗體效價(jià)顯著升高，說(shuō)明表達(dá)出的蛋白可以進(jìn)一步研究以開(kāi)發(fā)亞單位疫苗，為生產(chǎn)實(shí)踐中PED預(yù)防奠定基礎(chǔ)。