肝硬化患者腸道菌群的初步分析及腸型分析

肝硬化是各種慢性肝病逐漸發(fā)展演變?yōu)楦闻K彌漫性纖維化、假小葉形成為主要特征的病理階段。肝硬化與發(fā)生原發(fā)性肝細胞癌的風險相關，晚期肝硬化是一種危及生命的疾病且治療選擇有限。因此，肝硬化造成了很大的公共衛(wèi)生負擔

。2014年全球肝硬化疾病新負擔估算研究表明

，肝硬化在2010年造成超過100萬人死亡。

采用單因素變量法考察了稱樣量對測定的影響。分別選用稱樣量為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g進行試驗，結果見表3。由表3可見：當稱樣量不大于1.0g時，測定結果的相對標準偏差(RSD)較大，這可能是因為稱樣量太小，樣品代表性較差；當稱樣量大于1.0g時，測量結果的RSD較小?？紤]到稱樣量大于3.0g時，消耗的硝酸-酒石酸混酸和滴定液體積會相應增多，最終實驗選擇稱樣量為2.0g。

本研究采集80例就診于福建省立醫(yī)院消化內科的肝硬化患者及40名福建省立醫(yī)院體檢中心健康志愿者的糞便標本，通過16s rDNA測序技術檢測糞便腸道菌群。首先，分析比較肝硬化組與健康對照組腸道菌群多樣性及組成的差異；其次，比較肝硬化代償期組與肝硬化失代償期組、不同Child-Pugh分級肝硬化組、肝硬化無合并腹水組與肝硬化合并腹水組腸道菌群的變化；再通過腸型分析，預測肝硬化腸型對于疾病及嚴重程度的判斷，旨在初步分析肝硬化患者腸道菌群的變化，為臨床輔助評估肝硬化病情提供多一個無創(chuàng)的新指標，也為從微生態(tài)角度治療肝硬化提供多一些臨床證據(jù)。

1 資料與方法

選取2019年1月至2019年12月就診于福建省立醫(yī)院消化內科的肝硬化患者80例，同期選取福建省立醫(yī)院體檢中心健康志愿者40名。肝硬化患者的納入標準：組織學或影像學符合肝硬化者可診斷為代償期肝硬化；在診斷肝硬化基礎上，出現(xiàn)門靜脈高壓相關并發(fā)癥如腹水、食管胃底靜脈曲張破裂出血、膿毒癥、肝性腦病、肝腎綜合征等者可診斷為失代償期肝硬化。肝硬化患者的排除標準：(1)合并嚴重心、腦、肺、腎等臟器功能不全者(不包括肝性腦病、肝肺綜合征、肝腎綜合征)；(2)既往有胃腸道手術病史及消化道腫瘤、腸易激綜合征、炎癥性腸病、感染性腹瀉等其他消化道疾??；(3)孕期、哺乳期婦女及兒童；(4)采集糞便標本前4周內應用過抗生素及微生態(tài)制劑。健康志愿者的排除標準：(1)呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、神經精神系統(tǒng)等慢性疾病者；(2)脂肪肝、糖尿病等代謝性疾病者；(3)BMI≥24 kg/m

；(4)酗酒者；(5)孕期、哺乳期婦女及兒童；(6)采集糞便標本前4周內應用過抗生素及微生態(tài)制劑。本研究經福建省立醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過[倫審科研第(K2018-09-010)號]，研究對象均簽署知情同意書。

收集研究對象基本臨床資料及留取當天第1次新鮮糞便標本0.3～0.5 ml(1 h內保存至標本盒)。樣本送至杭州晶佰生物科技有限公司，該公司采用天根生化科技(北京)有限公司的糞便基因組DNA提取試劑盒(DP328)提取樣品DNA，進行V3-V4 rDNA擴增子文庫構建(擴增引物：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′和5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。每個樣品文庫質控合格后，進行文庫Pooling及上機測序。使用軟件cutadapt(v1.18)將原始數(shù)據(jù)PE(paired-end)去引物，以確保數(shù)據(jù)是目標片段；使用軟件pandaseq(v2.11)將不含引物PE(paired-end)序列拼接成長tags；使用軟件python3對拼接長tags進行質控；采用軟件vsearch對高質量長序列進行去嵌合體；對去除嵌合體的高質量數(shù)據(jù)按相似度97%進行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類，挑選代表序列；使用rdp-classifier(v2.12)對代表序列進行物種注釋(數(shù)據(jù)庫為rdp-classifier)；使用Qiime流程得到OTU豐度表和物種豐度表，使用軟件R(v3.5.2)語言統(tǒng)計繪制物種組成柱狀圖、差異物種圖、主坐標分析(Principal Coordinats Analysis, PCoA)、腸型等圖表。

姜超，男，1978年10月生，陜西長安人，高級工程師，主要從事土地綜合開發(fā)和交通項目建設管理，E-mail：16361273@qq.com

2 結果

該研究共納入肝硬化患者80例，男50例，女30例，年齡(57.0±13.6)歲；健康志愿者40名，男20名，女20名，年齡(57.7±13.5)歲。兩組的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(

>0.05)。在肝硬化患者中，肝硬化代償期34例，肝硬化失代償期46例；Child-Pugh A級組45例，Child-Pugh B級組24例，Child-Pugh C級組11例。

2.4.1 差異物種比較：Child-Pugh A級組中主要有

__

、

、

，Child-Pugh B級組中主要有

、

、

，Child-Pugh C級組中主要有

(見圖5)。

2.3.2 腸型分析：腸道菌群以

(埃希氏菌屬)為主的肝硬化患者發(fā)展為失代償期肝硬化的風險是腸道菌群以

(普氏菌屬)為主的3.64倍(

<0.05，見圖4、表2)。因此可以推測，腸型Ⅰ(

)是肝硬化發(fā)展為失代償期的危險因素。

2.4.2 Child-Pugh評分與腸道菌群主要物種相關性分：

、

、

平均相對豐度百分比與Child-Pugh評分呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)；

、

、

平均相對豐度百分比與Child-Pugh評分呈負相關，差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)(見表3)。

2.3.1 差異物種比較：在屬水平，肝硬化失代償期組

__

、

、

平均相對豐度百分比小于肝硬化代償期組(

=0.004、0.029、0.004)，差異有統(tǒng)計學意義；

、

平均相對豐度百分比大于肝硬化代償期組，差異有統(tǒng)計學意義(

=0.003、0.001)(見圖3)。

2.2.2 腸型分析：腸道菌群以

(埃希氏菌屬)為主的人群罹患肝硬化的風險是腸道菌群以

(普氏菌屬)為主的人群的5.28倍(

<0.05)(見圖2、表1)。因此可以推測,腸型Ⅰ(

)是罹患肝硬化的危險因素。

在屬水平，肝硬化并發(fā)腹水組

__

、

平均相對豐度百分比小于肝硬化未并發(fā)腹水組，差異有統(tǒng)計學意義(

=0.025、0.001)；

、

平均相對豐度百分比大于肝硬化未并發(fā)腹水組，差異有統(tǒng)計學意義(

=-0.002、0.047)(見圖7)。

在此次提交的報告中，有一個來自OECD國家和中國的稅收和轉移支付前后基尼系數(shù)變化的圖表，采用的是2000年-2010年OECD國家和中國的數(shù)據(jù)。從表中可以看出，在稅收和轉移支付之前，除希臘與德國以外，各國基尼系數(shù)都在0.4以上，超過警戒線，于是各國都采取了稅收和轉移支付政策（如補貼），在這10年的區(qū)間內，大部分國家通過減稅和補貼，基尼系數(shù)都有明顯的下降，甚至降到警戒線以下。只有中國僅從0.443降至0.41，調節(jié)作用微乎其微。

2.2.1 差異物種比較：在屬水平，肝硬化組

(普氏菌屬)、

(糞棲桿菌屬)、

(羅斯拜瑞氏菌屬)、

__

(瘤胃球菌科下的未知屬)平均相對豐度百分比小于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(

=0.042、0.000、0.000、0.013)；

(埃希氏菌屬

志賀氏菌屬)、

(鏈球菌屬)平均相對豐度百分比大于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(

=0.023、1.702×10

)(見圖1)。

表2是2004—2018年國內移動閱讀研究排名前10位的高被引文獻，這些文獻主要來自于圖書情報學科領域，主題涉及移動圖書館的應用、移動信息服務、移動閱讀推廣、手機移動閱讀等方面。高產作者茆意宏有3篇文章位列被引頻次前十名，其3篇高被引文章重點關注了手機移動閱讀的過程及影響因素、圖書館移動信息服務的現(xiàn)狀及需求滿足對策等。

2.4.3 腸型分析：腸道菌群以

(埃希氏菌屬)為主的肝硬化患者發(fā)展為Child-Pugh C級的風險是腸道菌群以

(普氏菌屬)為主的患者的7.2倍(

<0.05)(見圖6、表4)。因此可以推測，腸型Ⅰ(

)是肝硬化患者發(fā)展為Child-Pugh C級的危險因素。

（2）黃土凍融循環(huán)的相關研究中仍然存在一個問題沒有攻克，即三場耦合的影響，該方面的相關研究結論較少，黃土體由于受到氣候、自重、其他附加荷載等多種因素影響，因此其自身溫度場、水分場、應力場均處于動態(tài)變化的狀態(tài)。同時，由于沒有現(xiàn)實成果作為支持，這一研究沒能從現(xiàn)實角度解決問題，對于該問題未來將仍需要進行研究，研究成果出現(xiàn)后才能解決困擾諸多專業(yè)學者的季節(jié)性凍土地區(qū)黃土災害問題。

3 討論

腸道有100萬億個微生物，有1 000～1 150種微生物群

。根據(jù)其功能大致可分為三類

：共生菌或益生菌，即專性厭氧的腸道優(yōu)勢菌，如乳酸菌、雙歧桿菌、擬桿菌等；共生菌即條件致病菌，如大腸埃希菌、腸球菌和鏈球菌等，其在適合數(shù)量時具有一定的生理功能，但達到一定數(shù)量時則致?。贿^路菌，多數(shù)具有致病性，如變形菌門、綠膿桿菌等，它們在微生態(tài)環(huán)境保持平衡的情況下數(shù)量較少不致病，但在腸道菌群失調的情況下可轉化為致病菌。

越來越多的研究表明，腸道微生態(tài)的變化與肝硬化的發(fā)生及其發(fā)展密切相關。已有研究表明，肝硬化患者在腸道菌群構成、菌群失調指數(shù)等方面與健康人均有顯著性差異

。本研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者腸道菌群存在微生態(tài)的失衡，如

的減少和

、

、

、

的增多。失代償性肝硬化組腸道菌群主要表現(xiàn)為

__

、

、

的減少及

、

的增多。另外，

和

的平均相對豐度百分比與Child-Pugh評分呈顯著正相關,與既往研究

大致相同。膽汁酸代謝異常、小腸細菌過度生長及小腸動力紊亂、病理性細菌移位、內毒素血癥、免疫防御受損是腸道菌群參與肝硬化發(fā)生發(fā)展的可能機制。

可產生膽酸鹽水解酶，參與膽汁酸的正常代謝過程。在肝硬化患者中可以觀察到膽汁酸的減少，從而導致如腸桿菌科等致病菌群和促炎微生物的過度生長。而

可與

協(xié)同釋放內毒素和炎癥因子，從而破壞腸道屏障功能

。革蘭氏陰性菌(尤其是大腸埃希菌)、腸球菌和鏈球菌最易轉移至腸系膜淋巴結，尤其是大腸桿菌是肝硬化患者自發(fā)性細菌感染最常見的病原菌

。某些大腸埃希菌菌株在暴露于炎癥應激時，腸黏膜移位更為嚴重

。據(jù)統(tǒng)計

，Child-C級肝硬化患者病理性細菌移位的發(fā)生率是Child-A級和Child-B級患者的4～10倍。病理性移位的細菌可通過釋放細胞因子和一氧化氮引發(fā)炎性反應，加速肝硬化的發(fā)展。同時，

的增加和

的減少可以抑制肝臟TLR4，進一步導致膽汁酸減少，加重了腸道菌群紊亂等惡性循環(huán)

。

這些具有裝備背景的案例加入后，明顯提高了學員學習的興趣，也使老師可以由這些案例引出機械制造工藝知識點，分析制造過程，加工缺陷防治，使課程案例式教學能順利開展。案例庫課堂應用結果表明，案例庫的使用明顯提高了教學效果，課程內容有了依托，有了支撐，不再空洞難懂；老師的授課更加生動、高效。

短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)是胃腸道中發(fā)酵膳食纖維的細菌產生的主要代謝產物，包括丁酸鹽、丙酸鹽、乙酸鹽等，其在腸道的上皮屏障、炎癥抑制、能量代謝等方面發(fā)揮了重要的作用。在腸道菌群中，

、

可產生乙酸鹽，

、

、

可產生丙酸鹽，

、

、

可產生丁酸鹽

。而Faecalibacterium能夠分泌具有抗炎特性的蛋白質

。在本研究中我們觀察到，在肝硬化患者腸道菌群中，能夠產生SCFAs或抗炎物質的菌群如

、

、

、

、

明顯減少,與Valerio等

的研究結果相一致。

(2)突發(fā)的大量漏漿，若是由于槽壁中的先天孔洞，應馬上停止施工，并加大孔內送漿量，以保持孔內泥漿面的高度；然后挖出導墻外側對應位置的土體，查找漏漿源頭進行封堵，待處理完成后才能繼續(xù)進行。

Santiago等

研究發(fā)現(xiàn)，與無腹水的患者相比，肝硬化腹水患者的血清微生物中脂多糖結合蛋白水平較高(一種微生物易位的標志)。在本研究中，肝硬化并發(fā)腹水患者的腸道菌群主要表現(xiàn)為

__

、

的減少及

、

的增多。這些致病菌與內毒素血癥、病理性細菌移位有顯著相關性，其產生的大量內毒素通過受損的腸屏障進入體循環(huán)，激活肝臟Kupffer細胞，使之釋放大量促炎細胞因子，進一步加重肝臟的損傷。因此，當患者未合并明顯的自發(fā)性腹膜炎，預防性抗感染治療可能是需要的。

既往研究

根據(jù)腸道菌群相對豐度百分比的差異將人類腸道菌群類型分為三種，分別是腸型Ⅰ(

)、腸型Ⅱ(

)、腸型Ⅲ(

)。研究表明

，腸型與長期飲食相關，其中腸型Ⅰ富含擬桿菌屬，與蛋白與動物脂肪為主的飲食結構有關；腸型Ⅱ中普氏菌屬豐度較高，與碳水化合物為主的飲食結構有關。本研究通過分析發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者的腸型與健康人群不同，主要為腸型Ⅰ(

)、腸型Ⅱ(

)、腸型Ⅲ(

)，并且研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群結構以

為主的個體更容易罹患肝硬化且更容易發(fā)展為嚴重的肝硬化，而以

為主的腸道菌群結構似乎是肝硬化的保護因素，研究表明

，以消耗碳水化合物的偏素飲食者的腸道菌群中，

占主導地位。但是否能夠運用腸型預測肝硬化的罹患風險及作為肝硬化進展的參考生物標志物，是否提倡肝硬化患者以碳水化合物為主食的飲食結構需要進一步研究證明。

在本研究中，我們通過16s rDNA測序技術對肝硬化患者腸道微生物群進行初步分析發(fā)現(xiàn)，有益菌群的減少而潛在致病菌的增加是肝硬化患者腸道菌群的特征，且此特征與肝硬化的嚴重程度呈明顯的正相關。但本研究納入的例數(shù)尚較少，肝硬化患者及健康志愿者均來自福建省立醫(yī)院，因此還需要大樣本多中心的研究。

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