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    荷載JQ1/紫杉醇 PLGA納米粒的制備

    2022-04-08 05:34:22劉騫王沐芳侯哲王韶鴻王慎興王鵬劉芷萱趙靜郝吉福
    山東科學(xué) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:血漿粒徑納米

    劉騫,王沐芳,侯哲,王韶鴻,王慎興,王鵬,劉芷萱,趙靜, 郝吉福*

    (1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)藥學(xué)院,山東 泰安 271016;2.山東省泰山療養(yǎng)院(山東省泰山醫(yī)院),山東 泰安 271016)

    近年來針對腫瘤開展的免疫治療倍受關(guān)注,但腫瘤細(xì)胞表面的程序性死亡配體1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)會與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)上程序性死亡受體1(programmed cell death receptor 1,PD-1)相互結(jié)合,耗竭CTL的功能,產(chǎn)生免疫逃逸,降低其對腫瘤的殺傷作用[1-2]。JQ1作為溴結(jié)構(gòu)域蛋白(bromodomain containing protein 4,BRD4)的有效抑制劑,能夠降低PD-L1在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá),解除腫瘤細(xì)胞對CTL的免疫抑制[3-5]。紫杉醇(paclitaxel,PTX)作為一線抗腫瘤藥物,其療效在肺癌、乳腺癌等臨床治療中得到證實(shí)。因此,本文提出聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物,一方面通過PTX殺傷腫瘤細(xì)胞釋放腫瘤抗原激活抗腫瘤免疫反應(yīng),另一方面利用JQ1降低腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)解除免疫抑制,共同發(fā)揮抗腫瘤的免疫治療。然而,由于JQ1和PTX水溶性差,難以制成注射劑而限制了其應(yīng)用。納米制劑在改善難溶性藥物的溶解性,實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)遞藥和提高生物利用度方面發(fā)揮著重要作用[6-7]。本研究擬以高分子聚合物材料聚乳酸(PLA)-羥基乙酸(PGA)共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)為載體,將PTX和JQ1荷載于PLGA納米粒中,實(shí)現(xiàn)兩種藥物的共同遞送,以期發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。

    1 儀器和材料

    1.1 儀器

    JY92-Ⅱ探頭式超聲波粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);K30超速離心機(jī)(德國Sigma公司);Mastersizer 3000激光粒度分析儀(英國馬爾文公司);VP-10A plus高效液色譜儀(日本島津公司);FDU-1200臺式冷凍干燥機(jī)(日本東京理化株式會社);流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

    1.2 藥品和試劑

    1.3 動物

    雄性SD大鼠,體重(230 g±20 g),購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司,合格證號SCXY(魯)20140007。

    2 方法和結(jié)果

    2.1 荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒的制備

    采用超聲乳化溶劑蒸發(fā)法制備荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒[8-9]。精密稱取10 mg PTX、5 mg JQ1與 200 mg PLGA,將三者溶于4.5 mL乙酸乙酯中,形成有機(jī)相(作為油相); 精密量取含有2.5 mg/mL的PVA水溶液20.0 mL作為水相,將油相與水相混合后,置于探頭式超聲波粉碎儀中,維持功率400 W條件下進(jìn)行超聲3 min,使形成外觀均勻的乳濁液。將該乳濁液置于磁力攪拌器中不斷攪拌,以除去有機(jī)溶劑。隨后將所得到的納米混懸劑進(jìn)行超速離心15 min(12 000 r/min),棄去含有游離藥物的上清液后將沉淀物用蒸餾水分散,洗滌兩次,同法離心收集沉淀,制備成荷載PTX/JQ1 的PLGA納米粒,經(jīng)冷凍干燥后備用。

    2.2 PLGA納米粒的粒徑測定及形貌觀察

    取0.5 mL所制備的荷載PTX/JQ1 的PLGA納米?;鞈乙?,采用激光粒度分析儀測定粒度和多分散指數(shù)(polydispersion index, PDI);另將所制備的PLGA納米粒適度稀釋,滴加在覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)上,干燥后以2%磷鎢鉬酸進(jìn)行負(fù)染制樣,采用透射電鏡觀察其外觀形貌。所測定的PLGA納米粒粒徑結(jié)果如圖1(a)所示,其粒徑呈單峰正態(tài)分布,平均粒徑大小為210 nm左右,PDI為0.153(<0.3),提示分散性良好,粒徑大小較為均勻。由透射電鏡結(jié)果圖1(b)可以看出,所制備的PLGA納米粒外觀呈圓整、規(guī)則的球狀結(jié)構(gòu),表面無黏連。

    圖1 荷載PTX/JQ1 的PLGA納米粒粒徑及透射電鏡圖

    2.3 荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒的包封率及載藥量測定

    所測得的PTX的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=26 956C-5 078(r=0.999 9),表明PTX在0.5~25.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;JQ1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=37 982C-13 470(r=0.999 2),表明 JQ1在1.25~25.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。由標(biāo)準(zhǔn)曲線及所測得的峰面積分別計(jì)算PTX和JQ1在凍干粉中的含量,作為PLGA納米粒中被包載的藥物量M包載。另根據(jù)處方中所投藥量M總量及所用PLGA的重量MPLGA,分別按公式(1)計(jì)算包封率(entrapment efficiency,pEE)與載藥量(drug loading,qDL)。

    (1)

    經(jīng)式(1)計(jì)算,可知PLGA納米粒中PTX的包封率及載藥量分別為(70.77±5.65)%,(6.43±0.51)%,(n=3);JQ1的包封率及載藥量分別為(57.3±4.31)%,(5.21±0.27)%,(n=3)。

    2.4 荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒大鼠體內(nèi)藥動學(xué)分析

    2.4.1 給藥方法及血樣處理

    取體重230 g左右的SD大鼠6只,給藥前一晚撤去飼料,禁食 12 h 以上,保持自由飲水。尾靜脈注射所制備的荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒混懸液,給藥劑量為4 mg/kg,分別在給藥后0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8 h于眼內(nèi)眥處取血約0.3 mL,置肝素化離心管中,3 000 r/min離心 10 min,分取血漿。精密吸取血漿100 μL,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,精密加入色譜純乙腈300 μL,渦旋混合3 min,12 000 r/min高速離心10 min,吸取上清液20 μL,采用高效液相色譜(HPLC)法測定PTX和JQ1的含量。

    2.4.2 血漿樣品中PTX和JQ1含量測定方法

    高效液相色譜條件同2.3項(xiàng)下PTX和JQ1測定方法。分別取實(shí)驗(yàn)大鼠的空白及含藥血漿各 100 μL,按2.4.1項(xiàng)下血漿樣品處理方法進(jìn)行處理后,進(jìn)行方法專屬性考察。結(jié)果表明血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾PTX和JQ1的測定,PTX和JQ1色譜峰的保留時間分別為6.5 min及14.5 min,結(jié)果見圖2。

    圖2 血漿樣品中PTX和JQ1的HPLC譜圖

    2.4.3 藥時曲線與數(shù)據(jù)處理

    將所測血漿樣品的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算不同時間點(diǎn)的血藥濃度,繪制藥時曲線,結(jié)果見圖3。將所測得的藥時數(shù)據(jù)經(jīng)DAS(drug and statistics)藥動學(xué)軟件進(jìn)行隔室模型擬合處理,以擬合度、AIC(Akaike′s information criterion)確定合適的模型。擬合的藥時曲線方程為:

    圖3 大鼠尾靜脈注射PLGA納米粒后PTX與JQ1血藥濃度-時間曲線(n=6)

    CPTX=7.26e-4.85t+0.87e-0.13t,

    (2)

    CJQ1=2.04e-4.07t+0.96e-0.29t。

    (3)

    測得PTX與JQ1主要的藥動學(xué)參數(shù)如下:分布相半衰期(t1/2α)為0.142 8、0.169 9 h,消除相半衰期(t1/2β)為5.27、2.37 h,血藥濃度曲線下面積(AUC)為8.155、3.793(μg·h)/mL,清除率(CL)為122.612、131.795 mL/(h·kg),表觀分布體積(V)為766.07、396.25 mL/kg。

    2.5 對B16黑色素瘤細(xì)胞PD-L1的影響

    2.5.1 細(xì)胞接種

    取對數(shù)生長期的B16細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后,1 000 r/min離心5 min,棄去上清液,收集細(xì)胞,以體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后以1×104個/孔的數(shù)目接種到無菌24孔板中,每孔添加1 mL含血清培養(yǎng)基,置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),至單層細(xì)胞覆蓋率到達(dá)70%~80% 時,進(jìn)行加藥共培養(yǎng)。

    2.5.2 給藥方案

    實(shí)驗(yàn)分組共分為六組:①為對照組(記為Untreated);②為0.5 μg/mL 的JQ1混懸液組(記為JQ1-S 0.5):稱取2.0 mg JQ1溶解在少量(<0.1 %)DMSO中,用培養(yǎng)基稀釋成濃度為0.5 μg/mL,加入培養(yǎng)孔中與細(xì)胞共培養(yǎng);③為0.25 μg/mL的JQ1混懸液組(記為JQ1-S 0.25);④為0.5 μg/mL 的PLGA納米粒組(記為JQ1-P 0.5):取制備的荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒凍干粉分散在培養(yǎng)基中,再稀釋至濃度為0.5 μg/mL,加入培養(yǎng)板中與細(xì)胞共培養(yǎng);⑤為0.25 μg/mL的PLGA納米粒組(記為JQ1-P 0.25)。細(xì)胞添加含藥培養(yǎng)基后共培養(yǎng)72 h,期間間隔36 h換液一次。

    2.5.3 細(xì)胞染色與檢測

    將培養(yǎng)72 h后的細(xì)胞棄去上層培養(yǎng)基,洗滌、消化、離心收集細(xì)胞。轉(zhuǎn)移至96孔板中,加入封閉液封閉。隨后加入50 μL配制好的表面抗體CD274-PE,混合均勻,4 ℃避光染色15 min,離心、洗滌除去多余抗體染液,最后加入A430進(jìn)行染色。將染色完成的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果采用FlowJo軟件進(jìn)行處理,分析策略及PD-L1的抑制情況見圖4。

    B16細(xì)胞表面存在的PD-L1蛋白也被稱為表面抗原分化簇274(CD274)。由圖4(b)可知對照組CD274表達(dá)量最高,表明腫瘤細(xì)胞表面存在著PD-L1的表達(dá);但經(jīng)JQ1和PLGA納米粒組處理后,均可降低B16黑色素瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá),然而在同等濃度條件下JQ1與PLGA納米粒組對腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明將JQ1制備成納米粒后,不影響JQ1的活性,仍能抑制PD-L1的表達(dá)。但在不同濃度下對抑制PD-L1表達(dá)情況存在著量效關(guān)系,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。

    圖4 荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒對PD-L1抑制情況

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)采用可生物降解高分子材料PLGA,構(gòu)建了共荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒遞送系統(tǒng),利用PTX的化療作用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡釋放抗原,結(jié)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑JQ1增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng),以期改善模型藥物PTX/JQ1難溶性及解決兩者合用共遞送的制劑問題。利用載體材料PLGA溶于有機(jī)溶劑不溶于水的特征,與模型藥物共溶于有機(jī)溶劑后,分散到含有乳化劑的水相中,形成乳濁液,通過蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑,使藥物與載體材料溶解度降低析出固體,從而形成骨架型PLGA納米粒遞送系統(tǒng)。前期研究表明通過改變處方中載體材料PLGA及乳化劑的濃度,以及超聲功率、超聲時間等制備工藝可以控制納米粒的粒度大小[10-11]。因此,所制備的PLGA納米粒可以作為兩種藥物共遞送的傳輸載體。

    由于所制備PLGA納米粒的平均粒徑為210 nm,符合靜脈注射給藥的要求,納米粒進(jìn)入體循環(huán)后,依靠滲透滯留增強(qiáng)的EPR效應(yīng)到達(dá)腫瘤部位,隨后PLGA納米粒降解釋放藥物發(fā)揮治療作用[12]。在藥動學(xué)研究中,利用DAS藥動學(xué)軟件按照不同隔室進(jìn)行模型擬合,發(fā)現(xiàn)二室模型的 AIC 值最小,提示經(jīng)尾靜脈注射荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒后,藥物在大鼠體內(nèi)動力學(xué)特征符合二室模型。

    在腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展過程中,腫瘤細(xì)胞表面蛋白PD-L1能與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合,產(chǎn)生抑制信號,耗竭T細(xì)胞正常功能,進(jìn)而產(chǎn)生免疫逃逸。而B16細(xì)胞用JQ1處理后,可顯著減少細(xì)胞表面免疫抑制蛋白PD-L1的表達(dá),提示JQ1可以通過降低PD-L1的表達(dá)解除免疫抑制,恢復(fù)機(jī)體抗腫瘤功能正?;?,進(jìn)而與紫杉醇聯(lián)用,通過殺傷腫瘤細(xì)胞釋放腫瘤抗原,激活機(jī)體免疫系統(tǒng),共同發(fā)揮對腫瘤的治療作用[13-14]。針對聯(lián)合療法治療腫瘤的特點(diǎn),今后尚需完成荷載PTX/JQ1的PLGA納米粒動物體內(nèi)抗腫瘤效果及作用機(jī)制的評價(jià)。

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