嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法治療胰腺癌的研究進(jìn)展

田靜 張之勇 白天凱 閆濱

1山東中醫(yī)藥大學(xué)（濟(jì)南 250355）；2山東第一醫(yī)科大學(xué)（濟(jì)南 250013）

據(jù)每年全球癌癥調(diào)查數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患病人數(shù)在世界各地都有增高的趨勢(shì)［1］。全球每年大約有40 萬人患有胰腺癌，331 000 多人因患胰腺癌死亡，5年存活率小于6%，尤其是在人類發(fā)展指數(shù)（HDI）高的國(guó)家，胰腺癌的發(fā)病率、流行率和病死率都比較高［2］。由于許多患者對(duì)傳統(tǒng)的治療方法產(chǎn)生了抗藥性，因此迫切需要開發(fā)新的有效安全的胰腺癌治療手段。近年來，嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor T?cell im?munotherapy，CAR?T）在治療惡性腫瘤中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［3］，大量臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明該技術(shù)在改善惡性腫瘤患者生存質(zhì)量以及延長(zhǎng)患者生存期方面取得了巨大的成功［4-6］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)已有20 余項(xiàng)CAR?T 治療產(chǎn)品正在臨床試驗(yàn)中，這標(biāo)志腫瘤治療已進(jìn)入新時(shí)代，CAR?T 免疫療法有望能夠治療癌癥并提高患者生存率。CAR?T 療法是通過提取患者本身T 細(xì)胞，在體外進(jìn)行基因修飾與改造后靜脈輸回患者體內(nèi)的治療方法。此方法應(yīng)用患者自體T 細(xì)胞，減少了異體免疫攻擊的同時(shí)也面臨著T 細(xì)胞質(zhì)量不佳的問題。本文就CAR?T 的基本組成、胰腺癌的熱門靶點(diǎn)及面臨的主要挑戰(zhàn)和進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CAR?T 的基本組成

CAR?T 的核心部件是嵌合抗原受體（CARs），包括腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)（ScFv 片段）、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)。其中ScFv 決定CAR 的特異性，胞內(nèi)信號(hào)區(qū)域關(guān)系著T 細(xì)胞活化增殖能力。當(dāng)ScFv 片段與腫瘤抗原特異性結(jié)合時(shí)就會(huì)刺激胞內(nèi)信號(hào)區(qū)域轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)從而激活CAR?T 細(xì)胞活化增殖并釋放顆粒素、顆粒素酶及IL?2、IL?10 等細(xì)胞因子殺傷腫瘤（圖1）。同時(shí)鈣依賴性Fas、FasL 殺傷也是T 細(xì)胞裂解靶細(xì)胞的主要通路［7］。后來研究者們?yōu)榱颂岣咔逗峡乖肿觽鬟f信號(hào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，對(duì)CARs 胞內(nèi)信號(hào)區(qū)進(jìn)行改造，包括加入CD28、4?1BB 等共刺激結(jié)構(gòu)域，或添加編碼基因使T 細(xì)胞表面表達(dá)額外的細(xì)胞因子等，CAR?T 從第一代變遷到第四代（圖2），成為了腫瘤免疫治療研究的新熱點(diǎn)。

圖1 CAR?T 細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制Fig.1 The main mechanism of CAR T cells killing tumor cell

圖2 CAR?T 的演化Fig.2 The evolution of CAR?T

2 CAR?T 治療胰腺癌的目標(biāo)抗原

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，CAR?T 療法經(jīng)過近幾年的迭代雖然增強(qiáng)了CAR?T 細(xì)胞的增殖能力及殺傷性，但治療效果依然有限。因?yàn)镃AR?T 細(xì)胞并不依賴于樹突狀細(xì)胞抗原的處理和遞呈來激活，而是直接與腫瘤細(xì)胞表面抗原特異性結(jié)合殺滅腫瘤，所以腫瘤特異性抗原靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)是治療癌癥的關(guān)鍵［8］。目前上市的5 款CAR?T 產(chǎn)品都是針對(duì)血液瘤靶點(diǎn)，其中4 個(gè)靶向CD19，一個(gè)靶向BCMA。但近幾年學(xué)者也探索到了實(shí)體瘤的一些相關(guān)腫瘤抗原，并在實(shí)驗(yàn)或臨床研究中取得了一定的成果。如胰腺癌細(xì)胞表面的間皮素、CD47、EGFR 等抗原表位，為CAR?T 治療胰腺癌提供更多的靶點(diǎn)選擇。

2.1 間皮素（mesothelin）間皮素是通過磷脂酰肌醇區(qū)（GPI）錨定在細(xì)胞質(zhì)膜上的糖蛋白。由于其在正常組織中的分布有限而在某些腫瘤組織高度表達(dá)，因此有望用于腫瘤的特異性治療［9］。所以研究者們?cè)O(shè)計(jì)了多種靶向間皮素抗原的治療手段如抗毒素、抗體、腫瘤疫苗及過繼性T 細(xì)胞等治療，并在臨床前及臨床實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果，顯示了間皮素作為靶點(diǎn)的潛力［10］。賓夕法尼亞大學(xué)和諾華公司開發(fā)了以間皮素為靶點(diǎn)的CAR?T 療法，在臨床試驗(yàn)中取得了有效的治療效果。HE 等［11］也構(gòu)建了靶向間皮素的嵌合抗原受體T 細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)表明，meso?CAR?T 細(xì)胞對(duì)高表達(dá)間皮素和高產(chǎn)IFN?γ 的ASPC1 細(xì)胞表現(xiàn)出快速?gòu)?qiáng)大的殺傷作用。另外，一項(xiàng)臨床治療也表明間皮素可作為治療胰腺癌的潛在靶點(diǎn)［12］。該治療中心納入3 例胰腺癌患者，在經(jīng)過靜脈輸入meso?CAR?T 細(xì)胞治療后，1 例患者病情穩(wěn)定且中位生存期延長(zhǎng)。

2.2 CD47除了間皮素抗原靶點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)［13］CD47 是胰腺癌的另一靶點(diǎn)。CD47 是免疫球蛋白超家族的糖蛋白，常在不同類型的血液和實(shí)體腫瘤中過表達(dá)，在阻斷吞噬、增加腫瘤生存、轉(zhuǎn)移和血管生成等方面發(fā)揮重要作用。CD47 除了作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑使用，還有研究［14］成功構(gòu)建了CD47 CAR?T 細(xì)胞，結(jié)果顯示在NSG 小鼠腫瘤內(nèi)注射CD47?CAR?T 細(xì)胞后可以顯著抑制BxPC3 胰腺異種移植瘤的生長(zhǎng)。人源化CD47?CAR?T細(xì)胞還能特異性殺死卵巢、胰腺和宮頸癌細(xì)胞系，并產(chǎn)生與CD47表達(dá)相關(guān)的IL?2因子。因此CD47?CAR?T細(xì)胞可以作為一種新型的細(xì)胞治療劑用于治療胰腺癌。

2.3 EGFR對(duì)于轉(zhuǎn)移性胰腺癌更難找到合適的靶點(diǎn)，增加了治療的困難性。LIU 等［15］提到在胰腺癌中檢測(cè)到了表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）并評(píng)估了自體抗EGFR?CAR?T 細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的安全性和有效性并表明EGFR 是一個(gè)合理的靶點(diǎn)。一項(xiàng)16 例患者入組的臨床實(shí)驗(yàn)，免疫組化檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平在50%以上后，6 個(gè)月內(nèi)接受1～3 個(gè)周期的EGFR?CAR?T 細(xì)胞輸注，結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞上EGFR 表達(dá)降低且患者病情穩(wěn)定，轉(zhuǎn)移性病灶縮小?？傊瓻GFR?CAR?T 細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性胰腺癌是安全有效的。

2.4 其他靶點(diǎn)除了上述研究較多的靶點(diǎn)外，CEA、CEACAM7、MUC1、αvβ6、HER?2/CD24、B7?H3 也具有治療胰腺癌的潛力（表1），為CAR?T 治療胰腺癌提供更多的選擇。但這些胰腺癌表面抗原多數(shù)是腫瘤相關(guān)抗原，這類抗原在其他正常組織中也可能表達(dá)，即在CAR?T 免疫治療過程中會(huì)出現(xiàn)“抗原逃逸”等風(fēng)險(xiǎn)，因此尋找新型腫瘤特異性抗原十分重要。有研究表明除了腫瘤表面抗原，胞內(nèi)也存在許多特異性抗原，開發(fā)胞內(nèi)抗原為減少“脫靶”現(xiàn)象提供了研究方向。另外，在輸注CAR?T 細(xì)胞治療前，采用單克隆抗體預(yù)先封閉正常組織低表達(dá)的靶抗原，也能減少后續(xù)治療中的脫靶現(xiàn)象及細(xì)胞毒性［22］。因此，雙靶點(diǎn)或多靶點(diǎn)也是CAR?T進(jìn)化的重要方向。

3 CAR?T 治療胰腺癌存在的挑戰(zhàn)

CAR?T 作為跨時(shí)代的治療手段，具有強(qiáng)大的腫瘤殺傷活性，安全性問題一直是關(guān)注的焦點(diǎn)。除了“抗原逃逸”等風(fēng)險(xiǎn)，腫瘤微環(huán)境的抑制、細(xì)胞因子釋放綜合征及CAR?T 細(xì)胞衰竭等挑戰(zhàn)也阻礙其治療的有效性。針對(duì)這些問題，各界學(xué)者們都在努力尋找可行的解決策略。

3.1 腫瘤微環(huán)境的抑制及解決策略實(shí)體瘤基質(zhì)細(xì)胞中含有大量的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，這些細(xì)胞通過分泌膠原蛋白，形成致密的腫瘤組織，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)間質(zhì)壓異常升高，形成阻擋CAR?T 細(xì)胞浸潤(rùn)的物理屏障［23］，另外實(shí)體瘤分泌的一些趨化因子如CXCL12 和CXCL5 也會(huì)阻礙CAR?T 細(xì)胞殺滅腫瘤。因此可通過改善CAR?T 細(xì)胞浸潤(rùn)來逆轉(zhuǎn)免疫微環(huán)境抑制，提高CAR?T 免疫療法在實(shí)體瘤中的療效［24］。在提高CAR?T 細(xì)胞浸潤(rùn)方面，一研究團(tuán)隊(duì)［25］在CAR?T 細(xì)胞中加入了一個(gè)基因開關(guān)，將這些基因改造過的T 細(xì)胞精確地送入腫瘤微環(huán)境中，然后在小鼠腫瘤的部位用激光脈沖照射，提高溫度到40～42 ℃激活基因開關(guān)，增加抗癌蛋白質(zhì)表達(dá)。這突破了腫瘤微環(huán)境的抑制并預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。KAVANAGH 團(tuán)隊(duì)［26］利用可逆滲透技術(shù)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的快速遞送，該技術(shù)通過精確控制目標(biāo)細(xì)胞與含有目的物質(zhì)的溶液接觸，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)輸送和隨后的細(xì)胞通透性逆轉(zhuǎn)。另外，Y?mAbs 公司研發(fā)一種靶向GD2 抗原的人源化單克隆抗體naxitamab，它可通過與腫瘤表面的GD2 抗原結(jié)合，觸發(fā)抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)并激活免疫系統(tǒng)中的補(bǔ)體系統(tǒng)，臨床前數(shù)據(jù)顯示它有助于CAR?T 逆轉(zhuǎn)細(xì)胞腫瘤微環(huán)境的免疫抑制。這些數(shù)據(jù)都顯示通過輔助手段可增加CAR?T 細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞表面抗原的結(jié)合，減免微環(huán)境抑制。但是控制腫瘤增長(zhǎng)的蛋白大多數(shù)在細(xì)胞核內(nèi)，探索胞內(nèi)特異性抗原仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

3.2 細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）及解決策略CRS是在CAR?T 治療過程中，T 細(xì)胞活化產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子，如IL?6、IL?10 等瞬間大量釋放所引起的免疫刺激和炎癥反應(yīng)［27］。目前靶向CD19、BCMA 和CD22 的CAR?T 細(xì)胞療法都出現(xiàn)過嚴(yán)重的CRS［28］。對(duì)此在CAR?T 基因中插入一個(gè)“可控基因”則可有效避免細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生。目前胰腺癌治療仍處于臨床前或臨床初期實(shí)驗(yàn)中，在經(jīng)CAR?T 治療后如何避免細(xì)胞因子風(fēng)暴仍是極大的挑戰(zhàn)。

3.3 CAR?T 細(xì)胞衰竭及解決策略CAR?T 在血液瘤中取得了一系列突破性進(jìn)展，但對(duì)實(shí)體瘤始終存在瓶頸。非抗原依賴性的激活為CAR?T 衰竭的主要原因，這也成為CAR?T 攻克胰腺癌的主要優(yōu)化方向。如有研究者構(gòu)建雙鏈嵌合受體STAR，其整合了CAR?T 的抗原識(shí)別與TCR 活化通路，比CAR?T 細(xì)胞具有更高的抗原敏感性，改善了T 細(xì)胞的持久性從而有望治療胰腺癌［29］。另外WEBER團(tuán)隊(duì)［30］發(fā)現(xiàn)可以通過表觀遺傳重塑讓衰竭CAR?T細(xì)胞重獲其功能。

4 創(chuàng)新CAR?T 聯(lián)合療法

面對(duì)CAR?T 治療存在的眾多阻礙，除針對(duì)CAR?T 本身進(jìn)行優(yōu)化外，還可通過CAR?T 療法聯(lián)合其他藥物或方法來增強(qiáng)殺滅胰腺癌的能力。

4.1 CAR?T 可與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合治療早期治療胰腺癌時(shí)，學(xué)者們都只是一味增強(qiáng)T 細(xì)胞活性，80年代后期研究者們才逐漸認(rèn)識(shí)到T 細(xì)胞抑制性通路在T 細(xì)胞活化的同時(shí)也同樣被激活。而免疫檢查點(diǎn)抑制劑能以單克隆抗體抑制劑的形式來阻斷這些抑制性信號(hào)通路，激活全身免疫、增強(qiáng)T 細(xì)胞活性，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，最終達(dá)到消滅腫瘤的目的［31］。因此檢查點(diǎn)抑制劑能夠阻斷抑制信號(hào)通路、活化CAR?T 細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)而發(fā)揮協(xié)同作用避免抗原逃逸，增強(qiáng)CAR?T 細(xì)胞的靶向性及殺滅腫瘤的活性。如YANG 團(tuán)隊(duì)［32］利用嵌合抗原受體T 細(xì)胞聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD?1/PD?L1 治療胰腺癌，結(jié)果顯示在體外能有效識(shí)別和清除80%的過表達(dá)PD?L1 的腫瘤細(xì)胞。CHONG 等［33］也曾報(bào)道一例難治性彌漫性B 大細(xì)胞淋巴瘤在經(jīng)CD19?CAR T 治療后無反應(yīng)，但在聯(lián)合派姆單抗治療后CAR?T 細(xì)胞活性大大增強(qiáng)且患者癥狀得到緩解。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)也曾提出，CAR?T 細(xì)胞治療與免疫檢查點(diǎn)阻斷療法聯(lián)合使用可有效治療實(shí)體腫瘤，同時(shí)GROSSER 等［34］指出目前單獨(dú)使用免疫檢查點(diǎn)阻斷療法治療胰腺癌等間皮瘤均效果不佳。這些結(jié)果均為CAR?T 細(xì)胞療法與檢查點(diǎn)免疫抑制劑結(jié)合使用提供理論依據(jù)。

4.2 CAR?T 與溶瘤病毒聯(lián)合治療溶瘤病毒（on?colytic viruses，OVs）可選擇性地感染腫瘤細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制并最終裂解細(xì)胞且能擴(kuò)大免疫細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)的浸潤(rùn)空間［35］，這為OVs 聯(lián)合CAR?T 療法突破胰腺癌免疫微環(huán)境提供了后續(xù)研究思路。經(jīng)過基因改造后的OVs 在進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，可進(jìn)一步分泌細(xì)胞免疫因子，激活機(jī)體自身免疫系統(tǒng)，靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。如呼腸弧病毒、HSV病毒、溶瘤腺病毒等都能作為攜帶編碼的基因片段的載體伴隨CAR?T 進(jìn)入腫瘤細(xì)胞中，以此裂解胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，改善胰腺癌的免疫微環(huán)境，增加腫瘤細(xì)胞暴露被殺傷的概率且對(duì)胰腺癌的轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。與其他病毒載體相比，溶瘤病毒具有宿主范圍廣、與人類基因同源、不致插入宿主基因突變的優(yōu)點(diǎn)，亦可作為構(gòu)建CAR?T 時(shí)的病毒載體。其中一研究團(tuán)隊(duì)［36］發(fā)現(xiàn)一種溶瘤病毒OV19t 和CD19?CAR?T 產(chǎn)生強(qiáng)大的協(xié)同效應(yīng)，廣泛殺死癌細(xì)胞。因此，弱致病性病毒的使用或許可改善CAR?T 治療胰腺癌的腫瘤微環(huán)境，為研究者們提供更多的思路。

4.3 CAR?T 與其他藥物聯(lián)合治療一些常見中藥或單體如人參皂苷、香菇多糖、靈芝多糖、豬苓多糖等可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子或直接阻斷、下調(diào)PD?1/PDL1機(jī)制來抑制腫瘤細(xì)胞增殖與遷移侵襲，CAR?T療法與抗腫瘤藥物聯(lián)合使用可增強(qiáng)免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原或相關(guān)抗原結(jié)合的能力，甚至完全浸潤(rùn)到腫瘤內(nèi)部治療癌癥。另外一些抗腫瘤藥物或化療藥物可輔助CAR?T 療法治療胰腺癌［37］。治療性癌癥疫苗也可通過特異性誘導(dǎo)T 細(xì)胞殺滅腫瘤，成為癌癥治療中的關(guān)鍵突破。一些研究發(fā)現(xiàn)［38］，針對(duì)腫瘤的雙特異性CAR?T 細(xì)胞和針對(duì)強(qiáng)免疫原性的內(nèi)源性T 細(xì)胞受體，在用免疫原性疫苗免疫后顯示出強(qiáng)大的擴(kuò)增能力和抗腫瘤活性，如基于巨細(xì)胞病毒（CMV）疫苗與CAR?T細(xì)胞相結(jié)合可協(xié)同促進(jìn)腫瘤清除。在多種小鼠模型實(shí)驗(yàn)中接種表達(dá)gp100 的病毒疫苗可增強(qiáng)T 細(xì)胞擴(kuò)增和腫瘤消退。

5 展望

除了CAR?T 治療方法外，有研究表明TCR?T和CAR?NK 在癌癥中取得了實(shí)質(zhì)性突破，認(rèn)為TCR和CAR?NK 能夠識(shí)別更大范圍的潛在腫瘤特異性抗原或能增強(qiáng)殺滅腫瘤效果［39］。大量實(shí)驗(yàn)表明在提供相同數(shù)量的細(xì)胞時(shí)，TCR?T 細(xì)胞和CAR?NK 細(xì)胞殺滅腫瘤的作用更強(qiáng)。因此使用TCR?T、CAR?NK 細(xì)胞或許可解決CAR?T 療法面臨的部分困難。另外鑒于目前CAR?T 細(xì)胞治療的成功和CAR?NK細(xì)胞療法的潛力，研究人員又把目標(biāo)放在了具有吞噬外源微生物的單核巨噬細(xì)胞上，前期實(shí)驗(yàn)表明CAR 巨噬細(xì)胞（CAR?M）在治療實(shí)體瘤上具有極大的研究潛力。目前已有兩個(gè)基于CAR?M 策略的臨床試驗(yàn)已獲得FDA 的批準(zhǔn)，這為胰腺癌的治療提供了另一種研究思路。相信隨著一代又一代CAR 的改良，胰腺癌等實(shí)體瘤的根除指日可待。