載bpV（PIC）的神經(jīng)干細胞聯(lián)合神經(jīng)營養(yǎng)素?3殼聚糖支架參與創(chuàng)傷性顱腦損傷后腦神經(jīng)修復的研究

李軍 管義祥 丁錦榮 劉小江 管誠

海安市人民醫(yī)院神經(jīng)外科（江蘇海安 226600）

由交通事故、高空墜落等造成的創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）引起的神經(jīng)受損會誘發(fā)多種神經(jīng)并發(fā)癥，并長期影響患者的生活［1］。但是研究顯示成年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后難以修復，而促進神經(jīng)元的再生和修復是保護TBI后神經(jīng)功能的關鍵［2］。目前TBI 的臨床治療方法主要包括手術治療、藥物治療、物理療法，但效果大都不盡理想。隨著神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）移植技術的發(fā)展，給TBI 神經(jīng)修復帶來了新的希望，NSCs 移植后在受損區(qū)域分化為神經(jīng)元替代因損傷凋亡的宿主神經(jīng)元，并且分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)類物質［3］。進一步的體內研究顯示，NSCs 的抑制可以促進神經(jīng)元的修復和再生，但移植后的NSCs 存活率相對低，所以療效仍有欠缺，治療方法待進一步改善［4］。PTEN 蛋白在腦組織中表達，并且當PTEN 失活，會促進神經(jīng)元的增殖、分化和軸突的形成［5］。牛細小病毒bpV（PIC）可在短期內強力抑制PTEN 蛋白，研究已經(jīng)顯示使用bpV 處理可促進NSCs的存活，并促進NSCs的增殖和分化［6］。殼聚糖支架因具有生物降解性、低抗原性、良好的生物相容性和無熱原效應等優(yōu)點，而被廣泛應用于腦組織工程中，研究顯示神經(jīng)營養(yǎng)素3（neuro?trophin 3，NT?3）修飾的殼聚糖支架可保護神經(jīng)元，并可促進對骨神經(jīng)損傷的修復［7］。本研究將載bpV（PIC）的神經(jīng)干細胞聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架移植到大鼠顱腦損傷區(qū)域，探討其對受損傷的神經(jīng)修復作用觀察大鼠神經(jīng)功能恢復的情況。

1 材料與方法

1.1 材料和設備Sprague?Dawley（SD）雄性大鼠（SPF 級，8～10 周，270～290 g）以及孕14 d 雌性大鼠來自南通大學實驗動物中，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2002?0019。SAR830/AP 呼吸機（CWE 公司，美國）。bpV（PIC）（ATCC 公司，美國）。NT?3殼聚糖支架（浙江金殼公司，中國）。莫里斯水迷宮（XR?XM101，上海新軟信息技術有限公司，中國）。HE 染色。Leica EM UC6 切片機（Leica 公司，德國）。BrdU 試劑盒（碧云天公司，中國）。

1.2 大鼠建模、分組和干預將90 只大鼠隨機分為對照組、TBI 組、TBI+NSCs 組、TBI+bpV（PIC）?NSCs 組、TBI+NT?3 殼聚糖組和TBI+bpV（PIC）?NSCs+NT?3 組（n=15）。根據(jù)參考文獻構建TBI 模型［8］，通過腹膜內注射水合氯醛（10%，3 mL/kg）麻醉大鼠，連接呼吸機，呼吸平穩(wěn)后常規(guī)消毒剃毛，暴露骨窗，使用小動物顱腦撞擊器敲擊模擬中度皮層損傷。對照組大鼠僅暴露骨窗不敲擊。根據(jù)組別，在敲擊后立即植入NSCs（1×106個）、bpV（PIC）?NSCs（1×106個）、NT?3 殼聚糖（1 各單位）或者負載bpV（PIC）?NSCs 的NT?3 殼聚糖（1×106個NSCs+1 各單位）［9-10］。然后縫合傷口，注射抗生素預防感染。

1.3 負載bpV（PIC）?NSCs 的NT?3 殼聚糖支架的制備孕14 d 雌性大鼠吸入過量二氧化碳安樂死，取出胎鼠，根據(jù)參考文獻［9］構建NSCs，將腦神經(jīng)組織使用胰蛋白酶37 ℃消化30 min，0.15%Ⅱ型膠原酶37 ℃、5% CO2中消化8 h 獲得原代NSCs。將NSCs 在含有10%胎牛血清的DMEM 中培養(yǎng)成具有干細胞特性的球狀聚集細胞團，加入10 μmol/L BrdU 標記48 h 備用。根據(jù)參考文獻［10］，取NSCs 消化后制成濃度為5×104/mL 的單細胞懸液，500 μL 細胞懸液接種在24 孔板上，每孔2.5×104個細胞。培養(yǎng)基中加入終濃度為200 nm 的bpV（PIC）孵育7 d。收集干細胞球，將1×106個NSCs 種植于NT?3 殼聚糖支架上，4 ℃孵育3 h，制備成負載bpV（PIC）?NSCs 的NT?3 殼聚糖支架。

1.4 檢測指標方法

1.4.1 mNSS 評分建模后3 h 和建模7 d 后通過mNSS 評分系統(tǒng)是評估大鼠神經(jīng)功能缺損的通用標準，包括了運動、感覺、反射和平衡測試［11］。mNSS 分數(shù)最高為18 分，分數(shù)越高，神經(jīng)損傷越嚴重。

1.4.2 水迷宮實驗［12］建模7 d 后進行。水迷宮注滿水，溫度控制在（25±1）℃。水池直徑為1.6 m，高度為40 cm。一個平臺隱藏在水面以下1 cm 處。第一階段（定位導航）：將小鼠依次靠墻放置在四象限水迷宮中，如果動物在90 s 內登上平臺區(qū)域，則記錄結束；如果動物在90 s 內沒有登上平臺區(qū)域，則用棍子將小鼠引導到平臺并在那里保持30 s。每只小鼠每天訓練4 次。試驗之間的間隔大于2 min。第二階段（探索）：第一至第四象限全部完成，拆除水迷宮平臺，將小鼠置于同一象限靠墻觀察動物90 s 的動作軌跡，記錄目標象限停留時間和穿越平臺次數(shù)，二者數(shù)值越低提示神經(jīng)功能損傷越嚴重。

1.4.3 HE染色大鼠吸入過量二氧化碳后安樂死，取出腦組織并在室溫下用4%多聚甲醛固定6 h。用乙醇脫水（從低濃度到高濃度）后，將組織包埋在石蠟中。然后將石蠟包埋的組織切成5 μm 的切片，并將這些切片固定在載玻片上。將載玻片在室溫下放入蘇木精中染色10 min。用自來水洗滌1～2 min 后，將玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片變藍。隨后用自來水清洗1～2 min 后，將玻片放入曙紅中10 s。在乙醇（濃度分別為70%、90%、95%和100%）中脫水后，將玻片置于二甲苯中2 min；重復此步驟一次。最后，用中性膠密封玻片。在倒置顯微鏡下觀察。

1.4.4 BrdU 染色檢測神經(jīng)元新生新增殖的細胞會利用具有綠色紅色光的BrdU 合成DNA，用4%的聚甲醛固定腦組織并用梯度醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度為5 μm 的組織玻片標本，根據(jù)試劑盒說明書加入100 μL 的滲透劑（PBS，0.5%TritonX?100），然后加入100 μL 的BrdU 染色反應液體。使用激光共聚焦顯微鏡觀察新生的神經(jīng)元。

1.5 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計分析使用SPSS 19 軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用重復測量方差分析，多組間兩兩比較要采用Bonferroni 校正。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 bpV（PIC）?NSCs 聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠mNSS 評分的影響建模后3 h，大鼠mNSS 評分升高且高于9 分，提示TBI 建模成功。建模后7 d，TBI+NSCs 組的mNSS 評分低于TBI 組（P<0.05）；TBI+bpV（PIC）?NSCs 組的mNSS 評分低于TBI+NSCs 組（P<0.05）；TBI+bpV（PIC）?NSCs+NT?3 組的mNSS 評分低于TBI+bpV（PIC）?NSCs 組（P<0.05）。見表1。

表1 bpv（PIC）?NSCs 聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠mNSS 評分的影響Tab.1 The effect of bpv（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on the mNSS score of TBI rats ±s，分

表1 bpv（PIC）?NSCs 聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠mNSS 評分的影響Tab.1 The effect of bpv（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on the mNSS score of TBI rats ±s，分

注：與對照組比較，aP<0.05；與TBI 組比較，bP<0.05；與TBI+NSCs組比較，cP<0.05；與TBI+TBI+NT-3殼聚糖組比較，dP<0.05

組別對照組TBI 組TBI+NSCs 組TBI+bpV（PIC）?NSCs 組TBI+NT?3 殼聚糖組TBI+bpV（PIC）?NSCs+NT?3 組F 值P 值建模后3 h 0±0 9.62±1.25a 9.58±1.31a 9.66±1.20a 9.52±1.36a 9.59±1.24a 14.058<0.001建模后7 d 0±0 9.39±1.56a 7.81±1.17ab 5.56±0.86abc 9.31±1.30a 3.12±0.54abcd 193.426<0.001

2.2 bpV（PIC）?NSCs 聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠神經(jīng)功能的影響6 組的水迷宮實驗結果比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。TBI 組的神經(jīng)功能水平低于對照組（P<0.05）；TBI+NSCs 組的神經(jīng)功能水平高于TBI 組（P<0.05）；TBI+bpV（PIC）?NSCs 組的神經(jīng)功能水平高于TBI+NSCs 組（P<0.05）；TBI+bpV（PIC）?NSCs+NT?3 組的神經(jīng)功能水平高于TBI+bpV（PIC）?NSCs組（P<0.05）。見表2。

表2 bpV（PIC）?NSCs 聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠神經(jīng)功能的影響Tab.2 Effect of bpv（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on nerve function of TBI rats x±s

2.3 bpV（PIC）?NSCs聯(lián)合NT?3殼聚糖支架對TBI大鼠腦組織病理學的影響對照組神經(jīng)元分布均勻，細胞核結構清晰。TBI 組的細胞核染色變深，細胞內出現(xiàn)空洞，出現(xiàn)間質性水腫。TBI+NSCs 組的損傷情況較TBI 組輕微改善。TBI+bpV（PIC）?NSCs 組的空洞和水腫情況顯著改善。TBI+NT?3殼聚糖組損傷情況與TBI 組相似。TBI+bpV（PIC）?NSCs+NT?3 組基本正常，優(yōu)于TBI+bpV（PIC）?NSCs組。見圖1。

圖1 HE 染色檢測bpV（PIC）?NSCs 聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠腦組織病理學的影響（×200）Fig.1 HE staining to detect the effect of bpV（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on the pathology of brain tissue in TBI rats（×200）

2.4 bpV（PIC）?NSCs聯(lián)合NT?3殼聚糖支架對TBI大鼠腦神經(jīng)元新生的影響對照組正常，有少量新生神經(jīng)元。TBI組新生數(shù)量較對照組略多。TBI+NSCs 組的新生神經(jīng)元顯著多于TBI 組；TBI+bpV（PIC）?NSCs 組的新生神經(jīng)元顯著多于TBI+NSCs組。TBI+NT?3 殼聚糖組的新生神經(jīng)元與TBI 組類似。TBI+bpV（PIC）?NSCs+NT?3 組的新生神經(jīng)元顯著多于TBI+bpV（PIC）?NSCs 組。見圖2、表3。

表3 bpv（PIC）?NSCs 聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠腦神經(jīng)元新生的影響Tab.3 The effect of bpv（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on brain neurogenesis in TBI rats ±s

表3 bpv（PIC）?NSCs 聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠腦神經(jīng)元新生的影響Tab.3 The effect of bpv（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on brain neurogenesis in TBI rats ±s

注：與對照組比較，aP<0.05；與TBI 組比較，bP<0.05；與TBI+NSCs組比較，cP<0.05；與TBI+TBI+NT?3殼聚糖組比較，dP<0.05

組別對照組TBI 組TBI+NSCs 組TBI+bpv（PIC）?NSCs 組TBI+NT?3 殼聚糖組TBI+bpv（PIC）?NSCs+NT?3 組F 值P 值新生神經(jīng)元數(shù)目3.27±0.31 8.22±0.79a 17.64±1.21ab 29.38±2.25ab 8.97±1.04a 42.05±3.52abcd 957.225<0.001

圖2 BrdU 染色檢測bpv（PIC）?NSCs 聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠腦神經(jīng)元新生的影響（×400）Fig.2 BrdU staining detection of bpv（PIC）?NSCs combined with NT?3 chitosan scaffold on TBI rat brain neurons（×400）

3 討論

TBI 后神經(jīng)功能障礙已經(jīng)成為意外傷害致死的首要原因［13］。研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身修復困難的原因主要在于神經(jīng)營養(yǎng)素的缺乏和膠質疤痕的空間阻隔，研究者們圍繞上述理論進行了廣泛的應用研究，但仍未有突破性的進展。成年人中樞神經(jīng)自身內在生長能力的低下是其再生困難的主因［14-15］。

現(xiàn)階段，研究已經(jīng)證實提高自身內在生長能力的措施主要在于兩方面，一是增加損傷局部神經(jīng)再生種子細胞數(shù)量，并促使其分化為神經(jīng)元，二是促進和引導軸突正確生長［16］?；诖?，研究TBI后如何提高神經(jīng)功能修復以改善TBI 的預后，成為當前針對TBI 研究的焦點。NSCs 具有分化成神經(jīng)元等細胞的潛能，并可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子促進神經(jīng)元修復，研究也證實了NSCs 移植會促進損傷修復，但是由于NSCs 移植后存活率較低，所以治療效果仍然有限［17］。PTEN 是調控神經(jīng)元凋亡、增殖、更新、分化的重要蛋白，其可通過抑制PI3K/AKT 信號通路的轉導影響抑制TBI 后神經(jīng)元的再生［18］，而抑制PTEN 則成為促進NSCs 存活和分化的重要策略。bpV（PIC）是一種特效的PTEN 抑制劑，并且研究已經(jīng)證實，使用bpV（PIC）可抑制PTEN 并促進NSCs 在體內和體外增殖和分化［19］。為探索一種治療急性脊髓損傷的新策略，本研究培養(yǎng)載bpV（PIC）?NSCs 進一步提高其移植后存活率，并進一步聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架移植到大鼠受損區(qū)域，探討其對受損傷的神經(jīng)修復作用，以期為該病的臨床治療提供參考。本次研究通過外科擊打的方式構建TBI 模型，并在建模后立即植入NSE或者bpV（PIC）修飾的NSCs。結果顯示NSCs 可促進神經(jīng)元再生和緩解神經(jīng)元損傷，并可提高神經(jīng)功能，但是其作用有限。分析認為NSCs 移植到顱腦受損區(qū)域能夠進一步分化成所需的神經(jīng)細胞，實現(xiàn)神經(jīng)回路局部重建，代償部分受損神經(jīng)細胞的功能；同時移植后的NSCs 促進多種神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌，改善TBI 后的局部微環(huán)境，防止進一步的繼發(fā)性神經(jīng)功能損害，有利于神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復；而bpV（PIC）修飾的NSCs 可顯著的緩解神經(jīng)損傷促進神經(jīng)元新生，顯著的促進神經(jīng)功能的恢復，其作用顯著優(yōu)于NSCs。結合文獻報道和本次研究結果，提示使用bpV（PIC）修飾抑制PTEN 后，NSCs的增殖、分化能力顯著升高，從而提高對TBI 大鼠神經(jīng)的修復作用。移植后的NSCs 能否長期存活是移植治療療效的關鍵因素，既往研究多通過單純的NSCs 移植治療TBI，但移植物的長期存活率在，有5%～30%不等，具有較高的可變性。而通過培養(yǎng)載有bpV（PIC）的NSCs 能夠抑制PTEN 表達，有利于提高NSCs 在體內的長期存活率，進而保障更多的神經(jīng)細胞增殖和分化，而分化后的NSCs 通過表達一些神經(jīng)遞質的受體，促進神經(jīng)功能恢復。

為進一步體改NSCs 的存活提高治療結果，本研究也利用NT?3 殼聚糖支架來負載NSCs。殼聚糖是一種天然生物聚合物，在結構上類似于糖胺聚糖。殼聚糖具有高度的生物相容性和可生物降解性，沒有毒性作用，并具有抑菌性，是最受青睞的軟骨、神經(jīng)等再生生物材料之一［20］，也是負載干細胞和維持干細胞存活的重要生物材料［21］。研究顯示，使用NT?3 修飾后的殼聚糖能夠為NSCs 提供營養(yǎng)，并促進NSCs 的存活，并在體內促進NSCs 修復神經(jīng)元損傷的功能［22］。殼聚糖支架的多孔三維立體結構能夠為移植的細胞提供了生長、營養(yǎng)代謝、分泌排泄、氣體交換提供良好的場所，同時也為分化后神經(jīng)細胞、新生神經(jīng)組織提供了必要的結構基礎，為軸突的生長提供了支架幫助神經(jīng)元突起與宿主腦組織建立突觸聯(lián)系。本此研究結果顯示，單獨使用NT?3 殼聚糖支架對TBI 大鼠的神經(jīng)功能沒有明顯的保護作用，但是與單獨的bpV（PIC）?NSCs 比較，bpV（PIC）?NSCs 聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架可更加顯著的恢復神經(jīng)元損傷，促進神經(jīng)元再生，并恢復大鼠的神經(jīng)功能。根據(jù)過往文獻報道和本次研究結果，提示NT?3 殼聚糖支架會進一步促進bpV（PIC）?NSCs 對TBI 后神經(jīng)功能的修復。

然而，本研究僅為定性實驗，關于bpV（PIC）?NSCs 聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架的有效性和安全性仍需要深入研究，其分子機制需要全面的、深入的分析，此外如何實現(xiàn)移植后更多的分化神經(jīng)元還需要進一步的干預研究，關于移植bpV（PIC）?NSCs聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架后局部微環(huán)境改善相關營養(yǎng)因子的分泌釋放需要進一步的免疫熒光標記來驗證。

綜上所述，聯(lián)合bpV（PIC）?NSCs 聯(lián)合NT?3 殼聚糖支架可顯著的促進TBI 大鼠的神經(jīng)修復，可能成為治療TBI 和改善患者預后的新方法。