LincRNA00858靶向miR?3126?5p影響肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲

雷林翰 鄭迪杰 吳純宸 鄭戩 謝華華 華豪 孫誠誼 喻超

貴州醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院（貴陽 550004）；貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科，貴州醫(yī)科大學肝膽胰脾重點實驗室，貴州省肝膽胰脾疾病研究所（貴陽 550004）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是侵襲性較強的惡性腫瘤，也是臨床上最常見的肝癌類型，預(yù)計到2025年全球肝癌發(fā)病人數(shù)將超過100 萬例［1］，但HCC 的治療情況并不令人滿意，究其原因主要在于發(fā)病機制尚未完全闡明，缺乏針對性的有效手段［2］。因此，深入研究HCC 病變過程的分子生物學機制及發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點是攻克HCC 的當務(wù)之急。目前研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（LncRNA）在肝癌、胰腺癌等各種癌癥中失調(diào)，這表明lncRNA可以作為新的治療靶點和潛在的生物標志物用于患者的診斷和預(yù)后［3-5］。Linc00858 長度為2 685 個核苷酸，在胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、宮頸癌等惡性腫瘤中均為異常高表達。有研究［6-9］指出Linc00858 可以通過調(diào)控多種microRNA，從而影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡，另外高表達Linc00858 還與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［10］。因此Linc00858 是在腫瘤靶向治療中很有前景的候選基因，然而在HCC 中Linc00858 的研究尚少。根據(jù)生物信息學分析，本研究選擇微小RNA?3126?5p（miR?3126?5p）作為Linc00858 的調(diào)控對象，通過初步探索Linc00858通過靶向調(diào)控miR?3126?5p 參與HCC 的增殖、遷移和侵襲的分子機制，以期探索新的HCC 治療靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本及細胞系通過收集2018年9月至2020年12月貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科共24 例經(jīng)病理診斷為肝細胞肝癌的手術(shù)切除標本。所有患者在手術(shù)前均未接受任何輔助放、化療。每例標本均取得癌組織和相應(yīng)的癌旁組織，所有手術(shù)標本使用液氮速凍，放置于-80 ℃冰箱保存。本研究獲得貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會同意，患者均簽署知情同意書。人正常肝細胞LO2和人肝癌細胞HUH?7，SK?HEP?1，HEP3B，MHCC?97H 及HEPG2 細胞系均購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。

1.2 實驗材料DMEM/High Glucose 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶消化液（含EDTA，含酚紅）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum）購自以色列biological industries 公司；Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄和PCR SYBRGREEN定量試劑盒均購自日本Takara生物技術(shù)有限公司，CCK?8 試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，Transwell 小室和Matrigel 基質(zhì)膠均購自美國Corning 公司，雙熒光素酶試劑盒購自美國Promega公司；兔抗人波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體、小鼠抗人E?鈣粘蛋白（E?cdherin）單克隆抗體、兔抗人細胞周期蛋白E1（cyclinE1）單克隆抗體、兔抗人周期素依賴性激酶2（CDK2）單克隆抗體、兔抗人抗Kip1（p27）單克隆抗體、兔抗人GAPDH 單克隆抗體均購自武漢三鷹生物工程有限公司；RIPA 裂解液、辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠和兔IgG（二抗）、超敏ECL化學發(fā)光即用型底物劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；PVDF 膜購自美國Sigma?Aldrich 公司；攜帶Linc00858cDNA的重組慢病毒及其陰性對照慢病毒、攜帶Linc00858?shRNA 的重組慢病毒及其陰性對照慢病毒、慢病毒感染增強液HitransG A 均購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司；miR?3126?5p mimics 和miR?3126?5p inhibitor 及其相應(yīng)陰性對照均購自廣州瑞博生物科技有限公司。Linc00858 上游引物序列5'?TG?CAATCTGTTTAATGTGCCAGT?3'，下游引物序列5'?CTGGAGCACCTCTCTAAGAACC?3'；miR?3126?5p上游引物序列5'?ATGCGTGAGGGACAGATGC?3'，下游引物序列5'?GTCGTATCCAGTGCAGGGTC?3'；GAPDH 上游引物序列5'?GGAGCGAGATCCCTC?CAAAAT?3'，下游引物序列5'?GGCTGTTGTCATA?CTTCTCATGG?3'；U6 上游引物序列5'?CTCGCTTC?GGCAGCACA?3'，下游引物序列5'?ACGCTTCAC?GAATTTGCGT?3'。

1.3 試驗方法

1.3.1 實時熒光定量PCR使用Trizol 法提取出總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（日本Takara 公司）對提取出的總RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA；采用SYBR?Premix Ex TaqTM ⅡKit（日本Takara 公司）進行qRT?PCR 分析；分別以GAPDH 和U6 作為Linc00858 和miR?3126?5p 的內(nèi)參。以2?ΔΔCt法值表示目的基因的相對表達水平。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染和分組將正常肝細胞和各肝癌細胞系從液氮罐中取出，37 ℃水浴鍋復(fù)蘇，用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（10%FBS、1%青鏈霉素），放置于恒溫37 ℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。選取生長狀態(tài)良好的HUH?7 細胞，將其在6 孔板中進行鋪板，每孔密度為1×105個/孔，使用慢病毒感染增強液HitransG A 進行重組慢病毒感染，12～16 h 后更換新鮮培養(yǎng)基；分組為Empty Vector組（陰性對照組）和pcDNA?Linc00858 組；分別使用mimics?NC、miR?3126?5p mimics 與Linc00858 過表達慢病毒共轉(zhuǎn)染HUH?7 細胞，分組為pcDNA?Linc00858+miR?NC 組與pcDNA?Linc00858+miR?3126?5p mimics 組；MCHH?97H 細胞的轉(zhuǎn)染方式如上，分組為sh?NC 組（陰性對照）組和sh?Linc00858組，分別使用inhibitor?NC、miR?3126?5p inhibitor 與sh?Linc00858 共轉(zhuǎn)染MCHH?97H 細胞，分組為sh?Linc00858+anti?NC 組和sh?Linc00858+anti?miR?3126?5p 組；以上步驟均嚴格按照吉凱基因公司《重組慢病毒載體使用手冊》和銳博生物公司《miRNA 產(chǎn)品使用說明》進行操作，篩選出穩(wěn)定表達的細胞株，并采用qRT?PCR 法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 CCK?8法檢測細胞增殖各組細胞按照3×103個/孔的密度接種于96 孔板中，四周每孔加入100 μL PBS 以減少蒸發(fā)，隨后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后觀察。分別取6、24、48、72 h 共4 個時間點，每孔加入10 μL 的CCK?8 試劑后避光孵育2 h，隨后利用酶標儀在450 nm 的波長下檢測其吸光值（OD值），并繪制生長曲線。每組設(shè)置5 個復(fù)孔，且每組實驗重復(fù)3 次。

1.3.4 Transwell 法檢測細胞遷移和侵襲能力將Matrigel 膠與無血清DMEM 培養(yǎng)基按1∶8 的比例配比稀釋，在每個小室中加入60 μL 基質(zhì)，置37 ℃30～60 min（培養(yǎng)箱內(nèi)）使膠凝固。用200 μL 的無血清培養(yǎng)基將各組細胞密度調(diào)整為1×105個/孔，將其加入到侵襲小室內(nèi)，每種細胞種3 個小室。下室加入含20% FBS 的完全培養(yǎng)基600 μL，培養(yǎng)24～48 h 后。棄去小室內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次。4%的多聚甲醇固定20～30 min，用0.1%結(jié)晶紫染色20～30 min，用清水洗3 次，用棉簽輕輕拭去小室的上室膜中未穿過小室的細胞，待烘箱將其烘干后，在倒置光學顯微鏡選取5 個視野拍照記錄，將各組細胞進行計數(shù)匯總，再進行統(tǒng)計學分析。Transwell 遷移實驗中，小室不鋪Matrigel 膠，其余步驟與前述的侵襲實驗相同。

1.3.5 雙熒光素酶報告基因檢測構(gòu)建含有miR?3126?5p 結(jié)合位點的（3'UTR）雙熒光報告基因載體（廣州市銳博生物科技有限公司），即linc00858野生型（linc00858?wt）質(zhì)粒、linc00858突變型（linc00858?mut）質(zhì)粒。將HUH?7 細胞接種于96 孔板中，孵育至細胞密度達70%。然后，將WT·Linc00858、MUT·Linc00858 與miR?3126?5p mimics 共轉(zhuǎn)染HUH?7 細胞中。根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明書，采用雙熒光素酶試劑盒（美國promega 公司）測定各組細胞的熒光素酶活性。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測HUH?7 和MHCC?97H細胞中上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）和細胞周期相關(guān)的蛋白表達水平的影響使用胰蛋白酶將各組細胞消化處理后，使用RIPA 細胞裂解液分別提取各組細胞的總蛋白，行SDS?PAGE，在90 V 下分離處理后的蛋白樣本30 min 后再在110 V 下分離70 min，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5% 脫脂牛奶的封閉液封閉2 h，放置于針對Vimentin、E?cdherin、cyclin E1、CDK2、p27 和GAPDH 的特異性一抗（體積稀釋比例均為1∶1 000）中，于4 ℃下?lián)u床反應(yīng)過夜；隨后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/小鼠IgG（體積稀釋比例均為1∶5 000）的二抗中，室溫下?lián)u床反應(yīng)2 h，然后將超敏ECL 化學發(fā)光液（A 液：B 液為1∶1）滴加在條帶上，凝膠成像儀采集圖像，最后用ImageJ1.42 軟件進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學方法所有實驗至少獨立重復(fù)3次，統(tǒng)計分析使用SPSS 22.0 軟件。正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用LSD?t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Linc00858 在人肝癌組織和肝癌細胞系中高表達根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析，Linc00858在肝癌組織中的表達情況明顯高于癌旁組織（P<0.05），見圖1A。qRT?PCR 結(jié)果顯示，相比癌旁正常組織，肝癌組織中Linc00858 的表達水平較高（P<0.05），見圖1B；在肝癌細胞系中的Linc00858的相對表達量也顯著高于正常肝細胞LO2（P<0.05），見圖1C；篩選出相對表達量最高的MHCC?97H 和最低的HUH?7 作為后續(xù)研究對象。

圖1 Linc00858 在肝癌組織及細胞中表達情況Fig.1 The expression of Linc00858 in hepatoma tissue and cell

2.2 Linc00858 對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響qRT?PCR檢測結(jié)果顯示：pcDNA?Linc00858組的Linc00858 表達水平明顯高于Empty Vector組，sh?Linc00858 組的Linc00858 表達水平明顯低于sh?NC組（P<0.05），見圖2A。與Empty Vector 組對比，pcDNA?Linc00858 組的細胞增殖、遷移和侵襲能力均顯著上升（P<0.05），見圖2B-D，同時cyclin E1、Vimentin 和CDK2 的蛋白表達水平明顯上升，而p27 和E?cadherin 的表達水平則明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2E。和sh?NC 組比較顯示，sh?Linc00858 組的MHCC?97H細胞增殖、遷移和侵襲能力明顯下降（P<0.05），見圖2B、C、D；同時cyclin E1、Vimentin 和CDK2 的蛋白表達水平明顯下降，而p27 和E?cadherin 的表達水平則明顯上升，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2E。

圖2 改變Linc00858 的表達后對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲能力和相關(guān)蛋白表達情況的影響Fig.2 Effects of altered expression of Linc00858 on proliferation，migration，invasion and expression of related proteins in hepatocellular carcinoma cells

2.3 Linc00858靶向調(diào)控miR?3126?5p的表達通過starbase 網(wǎng)站（https：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）和LncBASE 網(wǎng)站（https：//labworm.com/tool/diana?lncbase）發(fā)現(xiàn)共有10 個microRNA 可能是其潛在的下游靶基因（圖3A）。qRT?PCR 檢測結(jié)果表示，在各組的對比中，miR?3126?5p 的表達量變化差異最為顯著（圖3B）。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果表明，miR?3126?5p mimics 能明顯降低WT?Linc00858 的熒光素酶活性（P<0.05），對MUT?Linc00858 則無明顯影響（圖3C）。qRT?PCR 檢測結(jié)果顯示，miR?3126?5p 在肝癌細胞系中的表達量也顯著低于人正常肝細胞LO2（P<0.05，圖3D）；Spearman 等級相關(guān)性實驗顯示，Linc00858 的表達和miR?3126?5p 呈負相關(guān)（圖3E）。以上結(jié)果均提示Linc00858 可以負向調(diào)控miR?3126?5p 的表達。

圖3 Linc00858 負向調(diào)控miR?3126?5p 的表達Fig.3 Linc00858 negatively regulates the expression of miR?3126?5p

2.4 改變miR?3126?5p 的表達水平能夠逆轉(zhuǎn)Linc00858 對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響在HUH?7 細胞中，mimics?miR?3126?5p 組的miR?3126?5p 表達水平明顯高于mimics?NC 組；而在MHCC?97H 細胞中，anti?miR?3126?5p 組的miR?3126?5p 表達水平明顯低于anti?NC 組（P<0.05，圖4A）。與pcDNA?Linc00858+mimics?NC 組相比，pcDNA?Linc00858+mimics?miR?3126?5p 組在HUH?7細胞中增殖、遷移及侵襲能力減弱；蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示對比pcDNA?Linc00858+mimics?NC 組，pcDNA?Linc00858+mimics?miR?3126?5p 組cyclin E1、Vimentin 和CDK2 的蛋白表達水平下降，而p27 和E?cadherin 的表達水平則上升（圖4E）；與sh?Linc00858+anti?NC 組相比，sh?Linc00858+anti?miR?3126?5p 組在MHCC?97H 細胞中增殖、遷移及侵襲能力增強，發(fā)生了逆轉(zhuǎn)（圖4B-D），蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示對比sh?Linc00858+anti?NC 組，sh?Linc00858+anti?miR?3126?5p 組的cyclin E1、Vi?mentin 和CDK2 的蛋白表達水平上升，而p27 和E?cadherin 的表達水平則下降（圖4E）。

圖4 改變miR?3126?5p 的表達水平后對Linc00858 導致的肝癌細胞增殖、遷移、侵襲能力和相關(guān)蛋白表達情況的影響Fig.4 Effects of altered miR?3126?5p expression on proliferation，migration，invasion and related protein expression of hepatoma cells induced by Linc00858

3 討論

HCC 是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡率的第二大原因［11］，其中發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)是影響患者結(jié)局的主要原因之一［12］。目前，手術(shù)切除后化療是最常見的HCC 治療方案，但患者結(jié)局卻不盡如人意，患者生存時間未能明顯延長［13］，因此探索侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制對于HCC 的分子診斷、預(yù)防和治療具有重要意義。LncRNA 通常位于細胞的細胞核和細胞質(zhì)中，盡管不參與編碼蛋白質(zhì)，但許多研究表明LncRNA 在細胞發(fā)育、分化和遷移等生物學過程扮演了重要角色［14-16］。劉澤鋒等［17］發(fā)現(xiàn)，LncRNA DUXAP8 通過增加m6A 甲基化介導的穩(wěn)定性來維持其表達上調(diào)核糖核酸。DUXAP8 水平，這與肝癌細胞增殖、遷移、侵襲和化療耐藥正相關(guān)。LncRNA有作為HCC 潛在的生物標志物和分子靶向治療靶標的可能性。

本研究發(fā)現(xiàn)Linc00858 在肝癌組織和細胞中的均呈高表達，并且其能促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在抑制Linc00858 的表達后，其能通過上調(diào)p27 的表達，從而抑制CDK2?Cyclin E1 的蛋白激酶復(fù)合物，而cyclin E1和CDK2是細胞周期G1和S 期轉(zhuǎn)換的限速因子，p27 能抑制cyclin E1 與細胞周期依賴性蛋白結(jié)合并誘導細胞周期阻滯從而抑制細胞的增殖；另外在上調(diào)了Linc00858表達后，上皮樣標志物E?cadherin 的表達降低，而間質(zhì)樣標志物Vimentin的表達上升，這提示Linc00858可能是通過EMT 現(xiàn)象增強了肝癌細胞的遷移和侵襲能力。本研究利用生物信息學數(shù)據(jù)庫分析miR?3126?5p可能是Linc00858 的潛在下游靶點，而目前研究［18］指出，在HCC 患者血清中的miR?3126?5p 的表達水平比健康人群顯著降低，并且其有可能作為HCC早期診斷的重要標記物。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蛁RT?PCR 結(jié)果顯示miR?3126?5p 的表達水平和Linc00858 呈負相關(guān)，且Linc00858 可以靶向調(diào)控miR?3126?5p 的表達。通過改變miR?3126?5p 的表達，本研究發(fā)現(xiàn)Linc00858 帶來的肝癌增殖、遷移和侵襲能力發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，此外細胞周期蛋白和EMT 相關(guān)蛋白的表達水平也發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。即Linc00858 可通過發(fā)揮ceRNA 機制來競爭性吸附miR?3126?5p，進而誘導細胞周期蛋白和EMT 相關(guān)蛋白的表達。此外，對于Linc00858 和細胞周期與EMT 相關(guān)蛋白之間的關(guān)系，仍需要進一步研究來闡明其具體調(diào)控機制。

綜上所述，本研究表明Linc00858 可以通過miR?3126?5p 調(diào)節(jié)細胞周期蛋白和EMT 相關(guān)蛋白的表達，并促進肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移，這表明Linc00858 有望成為肝癌治療的重要靶點。