基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法的2株木質(zhì)素降解菌固體菌劑的制備

李雅琳，李素艷，孫向陽，郝 丹，蔡琳琳，常曉彤

（北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北京 100083）

園林綠化廢棄物資源化利用[1-2]已成為研究熱點(diǎn)，其中堆肥化是一種比較理想的處理方式。由于園林綠化廢棄物木質(zhì)素含量較高、起始微生物數(shù)量較少等原因，堆肥效率較低，因此如何提高堆肥過程中的微生物數(shù)量成為推進(jìn)園林綠化廢棄物堆肥的關(guān)鍵[3-4]。添加微生物菌劑是提高堆體微生物數(shù)量最直接的方式之一。目前，針對木質(zhì)素降解的菌劑較少，且多集中于液體菌劑。然而液體菌劑對無菌條件要求較高，運(yùn)輸及產(chǎn)品儲存有諸多不便[5]。固體菌劑在生產(chǎn)和儲存方面能彌補(bǔ)液體菌劑的不足，同時，固體菌劑生產(chǎn)成本更低、生產(chǎn)工藝也相對簡單，對促進(jìn)園林綠化廢棄物堆肥化過程的優(yōu)勢更明顯[6]。生產(chǎn)固體菌劑，除了設(shè)計固體發(fā)酵的培養(yǎng)基，還要優(yōu)化其發(fā)酵條件，主要流程為試驗設(shè)計、數(shù)學(xué)建模和優(yōu)化設(shè)計3個部分[7]。合理的試驗設(shè)計能用較少的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，從而獲取各因素范圍內(nèi)的最優(yōu)解。已有研究對于固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化多是使用響應(yīng)面法[8-9]。但是有研究發(fā)現(xiàn)[10]：人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法優(yōu)化培養(yǎng)基比響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基驗證結(jié)果更準(zhǔn)確，誤差更小。本研究擬采用單因素試驗和正交試驗確定作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源的較優(yōu)種類和水平，然后根據(jù)碳氮源優(yōu)化結(jié)果，通過單因素試驗確定外加營養(yǎng)組分種類，最后采用均勻?qū)嶒灲Y(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模與優(yōu)化，尋找2株木質(zhì)素降解菌的外加營養(yǎng)組分接種量和最佳固體培養(yǎng)基發(fā)酵條件，以期得到最大發(fā)酵生物量，制作高效固體菌劑用于園林綠化廢棄物堆肥。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株A為構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans、菌株Q為栓菌屬1種Trametessp.，均由北京林業(yè)大學(xué)土壤生物學(xué)實(shí)驗室分離并保藏。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸汁(200.000 g土豆去皮去芽，切成小塊，加蒸餾水1 L保持微沸30 min后過濾)，葡萄糖 20.000 g，蛋白胨 15.000 g，瓊脂 20.000 g，pH 自然。PDB 液體培養(yǎng)基：馬鈴薯浸汁 (同PDA培養(yǎng)基)，葡萄糖 20.000 g，蛋白胨15.000 g，pH自然。以上所有培養(yǎng)基均121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) ①菌株活化。將接種環(huán)置于酒精燈上燃燒，待冷卻后挑取PDA斜面上的少許菌株接種至PDA培養(yǎng)基，封口后置于恒溫培養(yǎng)箱活化。②液體菌種培養(yǎng)。將活化后純培養(yǎng)的目標(biāo)菌株的PDA培養(yǎng)基接至放有玻璃碎片的PDB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在IS-RDD3臺式恒溫振蕩器中以25 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)5 d。③固態(tài)發(fā)酵。以30.000 g麩皮為發(fā)酵基質(zhì)，添加碳氮源以及外加營養(yǎng)組分，于121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min后，冷卻至室溫備用。將液體菌種按20%的接種量(物料干質(zhì)量)加入無菌水中混勻，接入物料，調(diào)節(jié)料水比，攪拌均勻后置于25 ℃條件下培養(yǎng)7 d，重復(fù)3次。

1.2.2 制作固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基 ①碳氮源篩選。采用單因素試驗篩選固體發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮源種類。以麩皮為發(fā)酵基質(zhì)，在米糠、木質(zhì)素磺酸鈉、玉米粉、蔗糖中篩選碳源，在豆餅粉、蛋白胨、酒石酸胺、尿素中篩選氮源，比較不同碳氮源對2株木質(zhì)素降解菌生物量的影響，以選擇能促進(jìn)菌體生長發(fā)育的最佳碳氮源。采用L9(34)正交試驗確定最佳添加量。根據(jù)最佳碳氮源的篩選結(jié)果，選擇3個吸光度D(260)相對較高的添加量梯度進(jìn)行L9(34)正交試驗，探究碳氮源添加量對2株木質(zhì)素降解菌生物量的影響，優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)配方。②外加營養(yǎng)組分篩選。采用單因素試驗確定添加物質(zhì)種類。以麩皮為發(fā)酵基質(zhì)，在最佳碳氮源的基礎(chǔ)上中添加營養(yǎng)組分：硫酸鈣(CaSO4)、硫酸鎂(MgSO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、氯化鈉(NaCl)進(jìn)行外加營養(yǎng)組分篩選，重復(fù)3次，選擇3個D(260)最大的作為外加營養(yǎng)組分的種類，確定外加鈣鹽、鎂鹽、磷酸鹽等對菌株A和菌株Q生長的影響。③培養(yǎng)基配方優(yōu)化。采用均勻?qū)嶒炘O(shè)計結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模，進(jìn)一步優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的外加營養(yǎng)組分添加量及其他發(fā)酵條件。

1.2.3 菌絲生物量的測定 將液體菌種用紗布過濾，同時以無菌水充分洗滌過濾物，過濾物即為純菌體，在65 ℃的條件下烘干至恒量，留存?zhèn)溆谩＞芊Q取純菌體0.010、0.030、0.050、0.100、0.150和0.200 g，加入25.000 mL體積分?jǐn)?shù)為5%三氯乙酸溶液，80 ℃恒溫水浴中攪拌提取25 min，取出后冰浴冷卻，在4 ℃、8000 r·min-1條件下離心15 min，稀釋2倍，以體積分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸為對照，用分光光度計測定D(260)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線。發(fā)酵物置于65 ℃條件下烘干至恒量，取0.500 g烘干至恒量的固態(tài)發(fā)酵物測定D(260)(與上述提取純菌體中核酸的方式相同)。同時，以發(fā)酵7 d但未接種種子液的固態(tài)發(fā)酵物作為空白對照，在260 nm處測定提取液的D(260)，通過標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線預(yù)測菌絲干質(zhì)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 ①數(shù)據(jù)采用 Excel 2007 和 SPSS 22.0 處理。碳氮源優(yōu)化用單因素方差分析法，平均值多重比較用LSD最小顯著性差異法(P＜0.05)。②采用均勻?qū)嶒瀸?shí)現(xiàn)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模與優(yōu)化。其一，基于SmoothL1損失函數(shù)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。該網(wǎng)絡(luò)借鑒U-Net架構(gòu)設(shè)計了編碼器和解碼器，添加了殘差連接[11]，以緩解網(wǎng)絡(luò)退化問題[12]，并采用SmoothL1損失函數(shù)[13]最小化觀察值與模型預(yù)測值的誤差。損失函數(shù)如下所示：其二，基于AdamW算法[14]尋優(yōu)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、AdamW算法基于Pytorch[15]實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 純菌絲干質(zhì)量和核酸量的線性關(guān)系

由圖1可知：2株木質(zhì)素降解菌菌絲中的核酸量與菌絲干質(zhì)量在測試的范圍之內(nèi)可呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，說明通過測定D(260)來確定2株木質(zhì)素降解菌固態(tài)發(fā)酵生物量的方法可行。菌株Q的線性方程為yQ=4.349 3x+0.044 6，R2=0.998 6；菌株 A 的線性方程為yA=4.081 4x+0.046 3，R2=0.995 7。

圖1 菌絲中核酸量與菌絲干質(zhì)量的關(guān)系Figure 1 Relationship between the amount of nucleic acid in mycelium and the amount of mycelium

2.2 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

2.2.1 碳源對2株木質(zhì)素降解菌生物量的影響 由圖2可知：菌株A的4種碳源處理的D(260)差異不顯著(P＞0.05)，但木質(zhì)素磺酸鈉的D(260)最高，分別較米糠、玉米粉和蔗糖處理高出14.900%、8.800%和8.200%。菌株Q的3種碳源處理的D(260)差異不顯著(P＞0.05)，但玉米粉的D(260)最高，分別較木質(zhì)素磺酸鈉、米糠和蔗糖處理高出6.900%、3.600%和0.900%。菌株A為構(gòu)巢曲霉，分泌的木質(zhì)素降解相關(guān)酶系降解木質(zhì)素效果顯著[16-17]，同時木質(zhì)素磺酸鈉是木質(zhì)素磺化改性得到的衍生化產(chǎn)品，因此，相比其他3種碳源，木質(zhì)素磺酸鈉更有利于促進(jìn)菌株A細(xì)胞的快速生長，獲得較高的菌絲生物量[18]。菌株Q在以玉米粉為碳源時的生物量最高，可能是因為玉米粉中含有大量的糖分、淀粉、多種礦質(zhì)元素和維生素, 這些營養(yǎng)物質(zhì)有利于菌株Q的生長繁殖[19]。因此，選擇木質(zhì)素磺酸鈉作為菌株A的碳源，選用玉米粉作為菌株Q的碳源。

圖2 碳源對 2 株木質(zhì)素降解菌生物量的影響Figure 2 Effect of carbon source on the biomass of two lignindegrading bacteria

2.2.2 氮源對 2 株木質(zhì)素降解菌生物量的影響 由圖3可知：菌株A的4種氮源處理的D(260)差異不顯著(P＞0.05)，但豆餅粉的D(260)最高，分別較蛋白胨、酒石酸胺和尿素處理高出4.300%、3.000%和15.600%。菌株Q的D(260)在以豆餅粉為氮源時最高，且與其他處理差異顯著(P＜0.05)，分別較蛋白胨、酒石酸胺和尿素處理高出6.700%、8.200%和14.400%。豆餅粉含大量碳水化合物、蛋白質(zhì)及少量異黃酮類物質(zhì)和可溶性多糖，可作為發(fā)酵的氮源及生長因子，有利于生物量的積累[20-21]。同時，豆餅粉來源穩(wěn)定，價格低廉，能夠快速被微生物利用，因此，選用豆餅粉為后續(xù)實(shí)驗中菌株A和菌株Q的氮源。

圖3 氮源對 2 株木質(zhì)素降解菌生物量的影響Figure 3 Effect of nitrogen source on the biomass of two lignindegrading bacteria

2.2.3 碳氮源添加量對2株木質(zhì)素降解菌生物量的影響 由圖4所示：菌株A在以木質(zhì)素磺酸鈉為最佳碳源時，添加量為2.500%、5.000%、10.000%處理間的D(260)差異不顯著(P＞0.05)，但是數(shù)值相對較高。因此，菌株A的木質(zhì)素磺酸鈉選用2.500%、5.000%、10.000%添加量進(jìn)行正交試驗。菌株Q在以玉米粉為最佳碳源時，添加量為5.000%時D(260)值最高，與其他處理差異顯著(P＜0.05)，0.625%、2.500%的D(260)也相對較高，因此，菌株Q的玉米粉選用0.625%、2.500%、5.000%添加量進(jìn)行正交試驗。菌株Q在添加量為5.000%時生物量達(dá)到最高，可能是由于在培養(yǎng)空間一定時，玉米粉的添加量越多，通氣量降低，導(dǎo)致生物量的積累下降從而使菌株Q的生長受到了一定的抑制[16]。由圖5可知：菌株A以豆餅粉為最佳氮源時，5種不同添加量處理的D(260)差異不顯著(P＞0.05)。添加量為10.000%時D(260)最高，但是從經(jīng)濟(jì)角度考慮，最終選擇豆餅粉添加量為1.250%、2.500%、5.000%進(jìn)行正交試驗。菌株Q以豆餅粉為最佳氮源時，添加量為1.250%、5.000%、10.000%時的D(260)顯著高于另外2個添加量，因此選擇這3個梯度進(jìn)行正交試驗。

圖4 碳源添加量對 2 株木質(zhì)素降解菌生物量的影響Figure 4 Effect of carbon source addition on the biomass of two lignindegrading bacteria

圖5 氮源接種量對 2 株木質(zhì)素降解菌生物量的影響Figure 5 Effect of nitrogen source inoculum on the biomass of two lignin-degrading bacteria

2.2.4 正交試驗 由表1和表2可知：菌株A的碳氮源添加量為木質(zhì)素磺酸鈉5.000%、豆餅粉5.000%時D(260)最大，高達(dá)0.249。菌株Q的碳氮源添加量為玉米粉0.625%、豆餅粉10.000%時D(260)最大，高達(dá)0.261。因此選定菌株A的碳氮源添加量為木質(zhì)素磺酸鈉5.000%和豆餅粉5.000%，菌株Q的碳氮源添加量為豆餅粉10.000%和玉米粉0.625%。

表1 菌株 A 正交設(shè)計試驗 L9(34)Table 1 Orthogonal design experiment of strain A L9 (34)

表2 菌株 Q 正交設(shè)計試驗 L9(34)Table 2 Orthogonal design experiment of strain Q L9 (34)

2.3 外加營養(yǎng)組分篩選

由圖6表明：菌株A的5種外加營養(yǎng)組分處理的D(260)差異不顯著(P＞0.05)，但外加CaSO4、MgSO4、KH2PO4時的D(260)值最大，因此，這3種被定為最佳外加營養(yǎng)組分。微生物除了碳源和氮源，還需要一定量的無機(jī)鹽來調(diào)節(jié)其生長代謝。鎂鹽作為許多重要酶的激活劑能夠影響蛋白質(zhì)的合成以及基質(zhì)氧化；磷則是核酸和蛋白質(zhì)的重要組成成分，能夠影響微生物的生長[22]，這與本研究結(jié)果一致。

圖6 菌株 A 和菌株 Q 在不同營養(yǎng)組分培養(yǎng)基上的生長Figure 6 Growth of strain A and strain Q on the medium with different nutrient components

2.4 均勻?qū)嶒灲Y(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模與優(yōu)化

在以2.2.4和2.3實(shí)驗結(jié)果為前提的條件下，設(shè)計6因素5水平10組的均勻?qū)嶒?。再通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測，得到實(shí)測值與仿真值的對比(表3和表4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：各觀察值與測量值誤差較小，基本相同。綜上，該模型預(yù)測值具備參考性。

表3 菌株 Q 均勻?qū)嶒炘O(shè)計及結(jié)果Table 3 Strain Q uniform test design and results

表4 菌株 A 均勻試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Strain A uniform test design and results

2.5 菌株在優(yōu)化后固體發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長情況

如表5所示：按照人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法模型預(yù)測的優(yōu)化后固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗驗證，該優(yōu)化條件下菌株 Q 的D(260)為 0.6020，實(shí)測值為 0.5960，誤差為1.000%；預(yù)測得到菌株A的D(260)為0.4850，實(shí)測值為0.4780，誤差為1.500%。

表5 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)尋優(yōu)結(jié)果Table 5 Optimization results of artificial neural network

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法優(yōu)化后菌株Q的預(yù)測值為0.6020，實(shí)測值為0.5960，誤差為1.000%；菌株A的預(yù)測值為0.485，實(shí)測值為0.478，誤差為1.500%?；谌斯ど窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的模型擬合度較好。

根據(jù)單因素試驗和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法結(jié)果，確定了2株木質(zhì)素降解菌的最優(yōu)固體發(fā)酵條件。菌株Q：固體菌劑培養(yǎng)基基質(zhì)為麩皮30.000 g作為基底，添加豆餅粉10.000%和玉米粉0.625%，外加營養(yǎng)組分為MgSO41.434%、KH2PO40.115% 和FeSO4·7H2O 1.497%；接種條件為接菌量 6.000%、料水比1.000∶0.992、保護(hù)劑1.000%。菌株A：固體菌劑培養(yǎng)基基質(zhì)為麩皮30.000g作為基底，添加豆餅粉5.000% 和木質(zhì)素磺酸鈉為 5.000%，外加營養(yǎng)組分為 MgSO40.123 %、KH2PO40.213 %、FeSO4·7H2O 1.280%；接種條件為接菌量21.000%、料水比1∶1、保護(hù)劑19.000%。