沙棘根瘤內(nèi)生菌株庫構(gòu)建與微生物多樣性分析

魏繼華，李佳益，劉 宏，張建國,2，羅紅梅，何彩云

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所 國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室，北京 100091；2.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；3.中國林業(yè)科學(xué)研究院 沙漠林業(yè)實驗中心，內(nèi)蒙古 磴口 015200）

沙棘Hippophae rhamnoides又名醋柳，是胡頹子科Elaeagnaceae沙棘屬Hippophae的落葉性灌木[1]。作為藥食同源植物的沙棘不僅在食療、醫(yī)藥、農(nóng)林牧漁等領(lǐng)域具有較大的經(jīng)濟價值，在水土保持、恢復(fù)生物鏈及防風(fēng)固沙中也具有極大的生態(tài)價值[2-5]。生長過程中沙棘根部會遭受土壤中放線菌、細菌的侵染形成根瘤。部分菌種會在根瘤中高度富集發(fā)揮固氮、促生長、抵御逆境脅迫、防止有害病菌侵染等功能[6-8]。傳統(tǒng)的微生物研究方法主要以培養(yǎng)基進行分離純培養(yǎng)，再進而探究其培養(yǎng)特征、顯微結(jié)構(gòu)、生理特性等[9]。而自然界中90%以上的微生物為不可培養(yǎng)微生物，且現(xiàn)有培養(yǎng)基與培養(yǎng)技術(shù)不適應(yīng)未知菌群的生長，或部分菌群生長緩慢、豐度較小等情況都會對菌群的多樣性評估產(chǎn)生影響[10]。以二代高通量測序為基礎(chǔ)的16S rDNA技術(shù)通過對編碼原核核糖體小亞基rRNA的DNA序列進行測序，不僅克服了傳統(tǒng)方法難以獲得不可培養(yǎng)菌株的弊端，還能對樣品中的物種相對豐度進行排序，并分析各群組樣品中發(fā)揮重要作用的優(yōu)勢物種，解析樣品中微生物之間的相互作用。該技術(shù)對研究沙棘根瘤內(nèi)生菌微生物多樣性與環(huán)境關(guān)系以及微生物資源的開發(fā)利用有重要的理論和現(xiàn)實意義[11-16]。

本研究通過16S rRNA測序技術(shù)對沙棘根瘤內(nèi)生菌進行物種注釋、分類學(xué)分析、α多樣性分析、β多樣性分析、組間差異顯著性分析，比較高通量測序和純培養(yǎng)方法的差異與優(yōu)劣，為發(fā)掘具有應(yīng)用價值的根瘤內(nèi)生菌資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

采樣地為內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市磴口縣中國林業(yè)科學(xué)研究院沙漠林業(yè)實驗中心試驗林場(40°29′34″N，106°74′06″E)。該研究區(qū)海拔為 1 054 m，年平均氣溫為 7.4 ℃。2020 年 7 月，選取人為干擾因素較少的沙漠邊緣地帶采集沙棘根瘤樣品。在每個樣地10 m×10 m的區(qū)域內(nèi)用網(wǎng)格法定9個點，運用梅花形采樣法在邊角及中心共5個點分別采集根瘤樣品并進行混合，共設(shè)計6組重復(fù)樣，分別命名為M1、M2、M3、M4、M5、M6。

1.2 沙棘根瘤內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)

1.2.1 沙棘根瘤內(nèi)生菌的分離 依據(jù)文獻[17-18]的方法進行修改，使其更加適宜沙棘根瘤內(nèi)生菌的分離。詳細步驟如下：選取新鮮飽滿的根瘤，沖洗掉土粒泥沙，將根瘤團用解剖刀分割成帶有單柄的瘤瓣，用紗布包裹，先用體積分數(shù)為95%的酒精溶液浸泡30 s，再用體積分數(shù)為10%的次氯酸鈉溶液表面滅菌5 min，取出后用無菌水沖洗數(shù)次。在滅菌濾紙上，用無菌解剖刀先切取根瘤頭部，再將其均分成2～3份薄片，置于固體培養(yǎng)基中28 ℃恒溫暗處靜置培養(yǎng)。根據(jù)相關(guān)研究，本研究選取BAP[19]、S[20]、JA[19]、高氏一號培養(yǎng)基[19]進行分離培養(yǎng)。

1.2.2 沙棘根瘤內(nèi)生菌的鑒定 提取純培養(yǎng)的沙棘根瘤內(nèi)生菌DNA后，對16S rDNA全長進行PCR擴增。序列引物采用YU等[21]設(shè)計的細菌通用引物(引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR 總反應(yīng)體系為 50 μL，包括 10×緩沖液 (KOD buffer)5 μL、2 mmol·L-1三磷酸脫氧核糖核苷酸混合液 (dNTPs) 5 μL、基因組 DNA (genomic DNA) 1 μL、上游引物 (forward primer) (10 μm) 1 μL、下游引物 (reverse primer) (10 μm) 1 μL、DNA 聚合酶 (KOD DNA polymerase) 1 μL、超純水 (ddH2O) 36 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性 3 min，94 ℃ 變性 30 s，58 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。用質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳，確定有特異擴增后，進行PCR產(chǎn)物回收和測序注釋，并參考文獻[22-25]進行比對校驗。

1.3 沙棘根瘤內(nèi)生菌的高通量測序分析

1.3.1 建庫測序 提取沙棘根瘤總 DNA 后，根據(jù) 16S rDNA 保守區(qū)設(shè)計引物 (引物序列 335F：5′-CADACTCCTACGGGAGGC-3′，769R：5′-ATCCTGTTTGMTMCCCVCRC-3′)，在引物末端加上測序接頭，便于建庫時添加能區(qū)分樣本的堿基序列的條碼/索引(barcode/index)。再進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行紫外分光光度計定量及混樣、過柱純化和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序[26]。高通量測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列，結(jié)果以FASTQ (簡稱為fq)文件格式存儲[27]。

1.3.2 測序數(shù)據(jù)處理 首先使用 Trimmomatic v.0.33 軟件[28]，對測序得到的原始測序序列進行過濾；其次使用cutadapt 1.9.1軟件進行引物序列的識別與去除，得到不包含引物序列的高質(zhì)量測序序列；然后使用FLASH v1.2.7軟件[29]，按照最小重疊(overlap)長度為10 bp、重疊區(qū)允許的最大錯配比率為0.2的要求，對每個樣品高質(zhì)量的一小段短的基因測序片段(reads)進行拼接，得到的拼接序列即原始序列質(zhì)控后的高質(zhì)量測序序列(clean reads)；最后使用UCHIME v4.2軟件[30]，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)。使用Usearch軟件對reads在97.0%的相似度水平下進行聚類，獲得分類操作單元(OTU)[31]，以測序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過濾OTU[32]。以SILVA (http://www.arb-silva.de/)為參考數(shù)據(jù)庫使用樸素貝葉斯分類器對特征序列進行分類學(xué)注釋，可得到每個特征對應(yīng)的物種分類信息，進而在各水平(門、綱、目、科、屬、種)統(tǒng)計樣品群落組成，利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R語言工具繪制樣品分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖[33]。使用QIIME軟件對樣品α多樣性進行評估和t檢驗(顯著性水平為0.01)。利用Mothur v1.30軟件和R語言工具包繪制稀釋曲線?；讵毩TU，采用加權(quán)分析方法和Bray-Curtis算法，使用QIIME軟件進行非加權(quán)組平均法(UPGMA)分析，比較各組樣品間的物種差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 分類操作單元 (OTU)聚類分析

使用Usearch軟件對clean reads在97.0%的相似度水平下進行聚類，共計獲得651個OTU。各樣品OTU個數(shù)分布較為均勻，樣品M1～M6分別為551、583、579、518、593、589個。如圖1所示：6組樣品中共有的OTU數(shù)為417個。M3、M5、M6中分別有4、2、9個特有的OTU，為樣品特有OTU，非單個樣品特有或所有樣品間共有的OTU在圖1未做展示。從整體來看，不同地點的各樣品間的OTU差異性遠小于共性，說明采樣方法設(shè)計合理。

圖1 沙棘(M1～M6)根瘤樣品分類操作單元(OTU)花瓣圖Figure 1 Petal image of operational taxonomic unit (OTU) of H.rhamnoides root nodule sample (M1－M6)

2.2 測序深度分析與 α 多樣性指數(shù)分析

對6組樣品測序共獲得 810 039對reads，雙端reads質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生 617 188 條 clean reads。其中質(zhì)量≥20的堿基占總堿基數(shù)的比例(Q20)為98.7%，質(zhì)量≥30的堿基占總堿基數(shù)的比例(Q30)為95.4%，表明測序質(zhì)量較好。從圖2可見：各樣品稀釋性曲線趨向平緩，表明在持續(xù)抽樣下新物種出現(xiàn)的速率逐漸趨于平緩，此環(huán)境中物種數(shù)量不會隨測序數(shù)量的增加而顯著增多[34]，說明取樣合理，能較好體現(xiàn)6組樣品中根瘤內(nèi)生菌的多樣性，可以進行數(shù)據(jù)分析。M5的Shannon和Simpson指數(shù)最大(表1)，說明物種多樣性最高。同理，M4的物種多樣性最低。物種豐度方面M5與M6差別不大，均有較高水平。M4根瘤樣品的物種豐度最低。樣點的Shannon指數(shù)平均為4.24，Simpson指數(shù)平均為0.70，Ace指數(shù)平均為585.79，Chao1指數(shù)平均為595.47，樣本文庫平均覆蓋率為99.95%。說明采樣地的沙棘根瘤內(nèi)生菌的物種豐富且多樣性較大，各物種分配相對均勻，其微生物物種信息得到了充分體現(xiàn)。

圖2 各樣品稀釋性曲線Figure 2 Dilution curve of each sample

表1 各組樣品的 α 多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index for each group of samples

2.3 傳統(tǒng)純培養(yǎng)與高通量測序分析沙棘根瘤內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)及其差異

通過傳統(tǒng)分離方法從BAP、JA、S、高氏一號培養(yǎng)基中得到純培養(yǎng)菌株96株。所有菌株均可傳代培養(yǎng)，但菌株之間培養(yǎng)周期差異較大，培養(yǎng)周期在1～30 d呈離散型分布。對各菌株進行分子鑒定，共有4門8綱8目13科19屬。在門的分類水平分別為變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、厚壁菌門Firmicutes和柔膜菌門Tenericutes。在屬的分類水平上，96株菌分屬于支原體屬Mycoptasma1株、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobim6株、土壤桿菌屬Agrobacterium7株、腸桿菌屬Enterobacter6株、小坂菌屬Kosakonia8株、檸檬酸桿菌屬Citrobacter1株、約克氏菌屬Yokenella1株、歐文氏菌屬Erwinia1株、克羅諾桿菌屬Cronobacter2株、泛菌屬Pantoea1株、莫拉菌屬Moraxella1株、貪噬菌屬Variovorax1株、草螺菌屬Herbaspirillum1株、假單胞菌屬Pseudomonas5株、鏈霉菌屬Streptomyces14株、小單孢菌屬Micromonospora1株、短桿菌屬Brevibacterium6株、葡萄球菌屬Straphylococcus1株和芽孢桿菌屬Bacillus32株。其中，優(yōu)勢門為變形菌門和厚壁菌門，優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬。

高通量測序分析發(fā)現(xiàn)：6組樣品共有14門34綱89目148科314屬。將相對豐度大于0.1%的門與相對豐度前10的屬進行匯總(圖3、表2、表3)發(fā)現(xiàn)：在門的分類水平上，6組樣品中相對豐度較高的主要為放線菌門和變形菌門，兩者相對豐度之和為87.5%～97.1%。其次為擬桿菌門Bacteroidetes、桿菌門Patescibacteria、厚壁菌門、酸桿菌門Acidobacteria。在屬的分類水平上，弗蘭克氏菌屬Frankia占絕對優(yōu)勢，相對豐度為20.12%～74.81%，平均相對豐度為51.49%。其次為根瘤菌屬Rhizobium、類固醇桿菌屬Steroidobacter、糖單孢菌屬Saccharimonadales、腸桿菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬、假黃色單胞菌屬Pseudoxanthomonas、鞘脂單胞菌屬Sphingomonas、假單胞菌屬、固氮弓菌屬Azoarcus、伯克氏菌屬Burkholderia、芽單胞菌屬Blastomonas、聚集桿菌屬Congregibacter、拉恩氏菌屬Rahnella、鞘氨醇菌屬Chitinophaga、獨島桿菌屬Dokdonella、普雷沃氏菌屬Prevotella、鏈霉菌屬、Microtrichales屬。

圖3 6組根瘤樣品的非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類樹與物種分布柱狀圖Figure 3 UPGMA clustering tree and the species distribution histogram of the six groups of nodule samples are combined drawing

表2 沙棘微生物區(qū)系門水平的相對分布Table 2 Relative abundance of microbiota taxa at the level of phylum

表3 沙棘微生物區(qū)系屬水平的相對分布Table 3 Relative abundance of microbiota taxa at the level of genus

在門、綱、目、科、屬的各分類單元中，高通量測序的檢測靈敏度(高通量測序/純培養(yǎng))依次是純培養(yǎng)方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。在門水平上，純培養(yǎng)菌株中占比較高的厚壁菌門在高通量測序中占比并不高。在屬水平上，純培養(yǎng)菌株中占比較高的芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬皆在高通量測序中占比很低。該對比結(jié)果差異性較大，說明高通量測序在微生物多樣性分析中占據(jù)優(yōu)勢地位，要優(yōu)于純培養(yǎng)方法。同時也說明，沙棘根瘤內(nèi)共生細菌群落結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，群落更為穩(wěn)定。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

在運用傳統(tǒng)方法分離純培養(yǎng)微生物時，共分離純培養(yǎng)菌株96株，分屬于4門8綱8目13科19屬，未獲得弗蘭克氏菌屬的菌株，可能是培養(yǎng)基中弗蘭克氏菌屬的菌株生長緩慢，易被其他菌群取代，因此仍需探索新的培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法以遏制根瘤中其他菌株的繁殖。在微生物多樣性分析中，由于環(huán)境中的微生物復(fù)雜多樣，各環(huán)境之間組成差異較大，通常采用非加權(quán)方法進行分析。該方法簡單易操作，主要考慮物種的有無，但未考慮物種的豐度，所以采用非加權(quán)的方法難以區(qū)別各樣品間的差異。

高通量測序分析共檢測到14門34綱89目148科314屬。在門、綱、目、科、屬的各分類單元中，高通量測序的檢測靈敏度(高通量測序/純培養(yǎng))依次是純培養(yǎng)方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。與純培養(yǎng)獲得的菌株相比，高通量測序分析結(jié)果更加完整地揭示了沙棘根瘤內(nèi)生菌的微生物多樣性。高通量測序表明：在門的分類水平上，樣品中相對豐度較高的主要為放線菌門和變形菌門，兩者相對豐度之和為87.5%～97.1%。在屬的分類水平上，弗蘭克氏菌屬占絕對優(yōu)勢，相對豐度為20.12%～74.81%，平均相對豐度為51.49%。

3.2 討論

張愛梅等[35]和劉志強等[36]分別對甘肅榆中、遼寧通遼、內(nèi)蒙古赤峰等地沙棘根瘤內(nèi)生菌微生物多樣性做過類似研究，其高通量測序所得的微生物多樣性高于本研究結(jié)果，說明沙棘根瘤內(nèi)生菌微生物多樣性受地理位置、土壤成分、氣候條件、宿主種類及生長環(huán)境等多種因素的影響。本研究的沙棘取樣于內(nèi)蒙古烏蘭察布沙漠邊緣地帶，采樣地荒漠化土壤與干旱少雨氣候?qū)?nèi)生菌多樣性有特別影響。

屬于非豆科Leguminosae植物的沙棘根瘤共生固氮體系是以弗蘭克氏菌屬為主導(dǎo)的[37]微生物—微生物—植物互作體系。高通量測序分析顯示：弗蘭克氏菌屬所占比例較高，然而本次傳統(tǒng)方法分離卻未得到純培養(yǎng)菌株，這可能是由于培養(yǎng)基中缺乏某種信號物質(zhì)或與其他菌屬競爭存在劣勢導(dǎo)致的，建議添加制霉菌素、萘啶酮酸和放線菌酮抑制其他菌群的繁殖[18]。非豆科植物結(jié)瘤固氮過程，單一屬的菌株難以完成此任務(wù)。有研究[38]表明：純培養(yǎng)分離的貪噬菌屬是復(fù)雜微生物組中維持根生長的核心菌屬，并且具有產(chǎn)生和降解生長素的能力，是細菌—細菌—植物通訊網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵角色。小單孢菌是植物益生菌，在促進植物生長的同時還可以分泌細胞壁降解酶促進細胞壁的降解，進而便于弗蘭克氏菌的侵染[39-40]，但是小單孢菌的快速繁殖也對弗蘭克氏菌的生長起到抑制作用。沙棘作為胡頹子科植物，根部結(jié)瘤侵染方式為細胞間侵入。研究[41]表明：草螺旋菌屬Spirillum、慢生根瘤菌屬、腸桿菌屬的相關(guān)細菌與弗蘭克氏菌存在負相關(guān)性(即抑制關(guān)系)，以上3個菌屬均在豆科、禾本科Poaceae植物中發(fā)揮固氮相關(guān)的重要作用，但在胡頹子科中此類細菌與弗蘭克氏菌屬相互作用的機制尚未明確。