基于納米材料增效的2，6-二叔丁基對甲酚分子印跡電化學傳感器的研究及應用*

冷鵬，李親凱，劉素

(1.山東城市建設職業(yè)學院，濟南 250103； 2.濟南大學資源與環(huán)境學院，濟南 250022)

2，6-二叔丁基對甲酚(BHT)是一種無臭無味但熱穩(wěn)定性良好的白色或淺黃色結晶體。BHT作為人工合成的抗氧化劑，屬于油溶性抗氧化劑，目前在我國生產量很大［1］。人們常在食品中添加適量的BHT以延遲和阻止食品氧化變質，但過量接觸和攝入容易對人體造成嚴重危害，如使人體呼吸酶的活性受到抑制，致癌等［2］。為防止和限制食品中BHT的添加使用量超標，GB／T 2760–1996明確規(guī)定了其使用量限值為0.2 g／kg［3］。目前，用于檢測食品中BHT含量的方法很多，其中常用的方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法、光度法及在線分析技術等［4–9］。這些方法靈敏度高，但儀器昂貴、樣品預處理復雜，且測試人員需經專業(yè)培訓才能完成檢測。生物傳感檢測是食品安全領域中的熱門檢測方法之一，生物體中的酶、抗體、組織等均具有特異性識別特定物質的能力，可以作為生物傳感器的識別分子［10］。生物傳感器的優(yōu)點是專一程度高、檢測速度快、操作相對簡單。不足之處在于穩(wěn)定性差、構建成本高且重復利用率低。分子印跡技術 (Molecular Imprinting Technology，MIT)就是把某一特定化學物質當作目標模板，制備對其特異性識別的分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)的過程［11–12］。該識別類似于抗原與抗體、酶與底物及激素藥物與受體等，具有高度的專一性和特異性。分子印跡聚合物具有結構可控性好、環(huán)境耐受性好且易于保存等特點，這種用聚合物作為識別元件構建得到的仿生傳感器，足以克服上述生物傳感器的諸多缺點［13］。筆者以BHT為檢測目標，利用分子印跡技術和表面修飾技術構建了一種基于納米材料增效的BHT分子印跡電化學傳感器(以下簡稱分子印跡傳感器)。

1 實驗部分

1．1 主要儀器與試劑

電化學工作站：VersaSTAT3型，美國阿美特克公司；

磁力攪拌器：海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；

電子天平：EL204型，梅特勒–托利多儀器有限公司；

三電極系統(tǒng)：鉑絲電極為對電極，Ag／AgCl電極為參比電極，修飾后的金電極為工作電極；

超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；

石墨粉、高錳酸鉀、濃硫酸、鹽酸、氯金酸(HAuCl4溶液質量分數(shù)為1%)、乙醇、甲醇、BHT、冰乙酸、硼氫化鈉(NaBH4)、鄰氨基苯硫酚(o-ATP)：分析純，阿拉丁有限公司(上海)；

磷酸緩沖液(PBS)：用磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉 (NaH2PO4·2H2O)和NaCl配制；

植物油脂：市購；實驗用水為超純去離子水；實驗所用其它試劑為分析純。

1．2 傳感器的制備

1.2.1 石墨烯的制備

將1 g石墨粉和0.5 g硝酸鈉加入到50 mL濃硫酸中，攪拌，再分多次將6 g高錳酸鉀加入到上述混合液中，于20℃水?。粩嚢? h后，于35℃水浴30 min，加入100 mL去離子水，持續(xù)攪拌20 min；加入適量的雙氧水，得溶液變成亮黃色后，趁熱過濾，用鹽酸洗滌，直至濾液中無硫酸根被檢出。將獲得固體置于真空干燥箱中，于60℃干燥2 h；稱取干燥物100 mg，于100 mL蒸餾水中超聲振蕩1 h后真空干燥，即得氧化石墨烯粉末。

稱取0.06 g氧化石墨烯置于盛有60 mL水的燒杯中，超聲分散8 h，加入1.5 mL PSS和0.5 mL水合肼，于90℃攪拌24 h，得到黑色分散液，用水沖洗多次，將所得物質超聲分散到15 mL水中，得到石墨烯溶液［14］。

1.2.2 鄰氨基苯硫酚功能化納米金(F-AuNPs)的制備

將32 mg氯金酸加入到10 mL乙醇中，將6 mg鄰氨基苯硫酚(o-ATP)加入到5 mL甲醇中，將二者混合，進行冰浴(0℃)并攪拌1 h，期間加入0.4 mL冰乙酸，得到黑褐色懸浮液。然后往該懸浮液中逐滴加入2.5 mL 0.5 mol／L NaBH4溶液，并繼續(xù)在冰浴環(huán)境中攪拌1 h，將得到的褐色溶液在室溫下靜置10 h。去除上清液，將剩余沉淀部分混勻，分批裝入離心管內，以1×104r／min離心10 min。將離心后所得到的沉淀依次用水洗滌多次，并分別用甲醇和乙醇溶液各洗滌2次。

1.2.3 分子印跡聚合物溶液的制備

取適量pH 6.5的PBS溶液，向溶液中加入適量BHT和F-AuNPs，溶液的濃度為5×10–3mol／L，于黑暗環(huán)境中靜置5 h以上，以此完成預組裝過程，即得到分子印跡聚合物溶液。

1.2.4 分子印跡傳感器界面的構建

分子印跡傳感器的構建如圖1所示。用移液槍吸取10 μL石墨烯均一溶液滴加到已處理好的金電極表面，室溫下過夜干燥；采用電聚合的方式將分子印跡聚合物沉積到石墨烯修飾電極表面［15–16］，電化學工作站掃描電壓為0.35～0.85 V，掃描速率為50 mV／s，掃描20圈。聚合物干燥后，采用0.1 mol／L的鹽酸溶液將模板分子BHT洗脫，即得到分子印跡電化學傳感器。

按照相同的構建程序組建非分子印跡傳感器，構建過程中的電聚合使用的聚合物不包含模板分子BHT。

圖1 分子印跡傳感器的構建原理

1．3 樣品預處理

以花生油作為檢測樣品，預處理程序：2.0 g樣品與5 mL乙醇充分融合12 h；分別取1.0 mL懸浮液以PBS溶液稀釋，備用。

1．4 電化學測量

修飾電極的表征在含有5 mmol／L K3［Fe(CN)6］和0.2 mol／L KCl水溶液中通過循環(huán)伏安法完成，掃描速率為50 mV／s，電壓范圍為–0.2～0.6 V。其它實驗通過差分脈沖伏安法完成，將修飾好的電極分別放入5 mmol／L的K3［Fe(CN)6］和0.2 mol／L的KCl水溶液中，電壓范圍為–0.2～0.6 V，掃描速率為5 mV／s。

2 結果與討論

2．1 電極修飾過程的循環(huán)伏安表征

通過循環(huán)伏安法對傳感器的構建過程進行表征，電極修飾過程的循環(huán)伏安曲線見圖2。a為裸電極循環(huán)伏安曲線；b為石墨烯修飾金電極的循環(huán)伏安曲線，由于石墨烯可以促進電子傳輸，該氧化還原峰電流響應相比于裸電極電流響應有明顯的增加；c為電聚合分子印跡聚合物后的循環(huán)伏安曲線，與曲線b相比，電信號有了顯著下降，這是因為分子印跡聚合膜阻斷了電極表面的電子傳遞：d為洗脫模板分子以后的循環(huán)伏安曲線，電信號有一定的增強，這是由于模板分子被洗脫掉之后，電極表面形成很多孔穴，這些孔穴增加了電子傳遞的有效表面積，促進了電子傳遞，進而提高了電極的電流響應。

a—裸金電極； b—石墨烯／金電極； c—MIPs／石墨烯／金電極；d—洗脫之后的MIPs／石墨烯／金電極圖2 電極修飾過程的循環(huán)伏安曲線

2．2 掃描圈數(shù)對分子印跡傳感器電流響應的影響

不同的掃描圈數(shù)會對電聚合膜厚度產生影響，而不同厚度的電聚合膜的分子印跡傳感器的穩(wěn)定性和靈敏度不同，采用循環(huán)伏安法對不同電聚合掃描圈數(shù)(5，10，15，20，25)的傳感器電流響應進行優(yōu)化，結果見圖3。由圖3可見，當掃描圈數(shù)從5增加到20時，傳感器的電流響應隨之增大并達到最大值。這是因為當電聚合圈數(shù)少于20圈時，電聚合膜會因為太薄而容易破裂，因此傳感器的電流響應相對較?。划敀呙枞?shù)大于20時，電聚合膜會因為太厚而使得模板分子不容易被洗脫，故所測得的傳感器電流響應有所下降。綜上考慮，選擇最佳掃描圈數(shù)為20圈。

圖3 電聚合掃描圈數(shù)對傳感器電流的影響

2．3 模板分子和功能單體摩爾比的優(yōu)化

由不同模板分子和功能單體的摩爾比構建得到的傳感器其性能有很大不同，因此需要對不同模板分子和功能單體的摩爾比進行優(yōu)化試驗，結果見圖4。由圖4可知，當模板分子與功能單體的摩爾比高于1∶1時，電流響應相對較小，這是因為若功能單體的數(shù)量過少，可能導致其不能與模板分子進行充分結合；當模板分子與功能單體的摩爾比低于1∶1時，電流響應同樣不斷下降，這可能是因為模板分子的數(shù)量太少而使功能單體過多地占據(jù)電極表面，從而導致結合位點過少，使電流響應不斷下降。當模板分子與功能單體的摩爾比為1∶1時，傳感器的電流響應達到最大。

圖4 模板分子與功能單體的摩爾比對傳感器電流響應的影響

2．4 洗脫時間的優(yōu)化

傳感器的識別能力與洗脫時間的長短密切相關，洗脫時間過長整個電聚合膜容易被洗脫掉；太短則模板分子不能被洗脫。因此用0.1 mol／L的鹽酸溶液分別對傳感器沖洗 5，10，15，20，25 min，并對傳感器的電流響應進行檢測，結果見圖5。

圖5 不同洗脫時間對傳感器電流響應的影響

由圖5可知，當洗脫時間低于10 min時，傳感器的電流響應逐漸增大并達到最大，很明顯模板分子被洗脫之后電極表面不斷形成很多孔穴，這些孔穴增加了電子傳遞的有效表面積，促進了電子傳遞，進而提高了電極的電流響應；當洗脫時間大于10 min時，電極表面修飾的聚合物與石墨烯會被洗脫掉，不能促進電子傳輸，故電流響應不斷減小。因此選擇洗脫時間為10 min。

2．5 分子印跡傳感器孵化時間優(yōu)化

將構建的分子印跡傳感器在5×10–3mol／L的BHT 溶液中分別浸泡 5，10，15，20，25 min，再對傳感器的響應電流進行檢測，結果見圖6。由圖6可知，孵化時間由5 min增大到20 min時電流響應不斷增加，這是因為在此孵化時間段內，模板分子在傳感器上的結合效果隨時間的延長而變得更好；當孵化時間超過20 min，傳感器表面的修飾物石墨烯和聚合物會脫落，故電流響應又會下降。因此最優(yōu)孵化時間為20 min。

圖6 不同孵化時間對傳感器電流響應的影響

2．6 分子印跡傳感器的標準曲線

為了研究構建得到的分子印跡傳感器的分析性能，利用DPV法對其線性檢測范圍和最低檢測限(LOD)進行測定。首先構建分子印跡和非分子印跡兩類電傳感器，然后將其在含有BHT的PBS緩沖液中浸泡20 min，進行DPV檢測，檢測結果見圖7。

a—分子印跡傳感器； b—非分子印跡傳感器圖7 傳感器的標準曲線

由圖7可知，分子印跡傳感器的檢測范圍為5×10–6～1×10–2mol／L，最低檢測限為 1.56×10–6mol／L。非分子印跡傳感器的電流響應和電流變化很小，不具備特異性識別BHT的能力。

2．7 分子印跡傳感器的特異性分析

選取幾種與BHT結構相似的物質作為干擾物，包括叔丁基氫醌(TBHQ)、叔丁基羥基茴香醚(BHA)和沒食子酸丙酯(PG)，以此來驗證所構建得到的分子印跡傳感器對模板分子的專一選擇的特性。其電流響應見圖8。由圖8可見，分子印跡傳感器的電流響應比非分子印跡傳感器的電流響應大，而且分子印跡電化學傳感器對BHT的選擇性好。

a—5×10–3 mol／L BHT 溶液； b—5×10–3 mol／L TBHQ ；c—5 ×10–3 mol／LBHA 溶液；d—5×10–3 mol／LPG 溶液圖8 分子印跡和非分子印跡傳感器對BHT選擇性識別

2．8 分子印跡傳感器的再現(xiàn)性、重復性和穩(wěn)定性

最優(yōu)條件下組建5支傳感器，每支電極只檢測一次濃度為 5×10–3mol／L 的 BHT 溶液，電流響應測 定 結 果 為 244.22，243.87，242.90，243.29，243.57 μA，相對標準偏差為4.6%，表明傳感器具有良好的再現(xiàn)性。在相同條件下組建5支分子印跡電化學傳感器，每支傳感器檢測5×10–3mol／L BHT溶液電流響應測定結果為 243.51，243.57，243.63 μA，相對標準偏差為4.8%。結果說明構建的傳感器可以實現(xiàn)對BHT的重復性檢測。制備3支傳感器，于室溫下保存2周，檢測傳感器的電流響應，得到的電流