閾值下微脈沖激光在糖尿病黃斑水腫中機制及應用的研究進展

趙芳 楊蘭 韓媛 何玉枚

糖尿病性黃斑水腫((diabetic macular edema，DME)是導致糖尿病患者視力嚴重損傷的常見原因，通常表現(xiàn)為視力下降、視物變形、視野缺損等，嚴重影響患者正常的生活。除了常規(guī)的傳統(tǒng)格柵樣激光及玻璃腔內(nèi)注藥術(shù)外，閾值下微脈沖激光也可應用于DME的治療中。微脈沖激光的特點是：高頻、短促、重復，并且選擇性地作用于RPE細胞，對其它結(jié)構(gòu)不造成損傷，達到其治療效應[1，2]，與傳統(tǒng)激光相比，安全性較高。每個脈沖通常為100～300 μs，每個脈沖之間有1700～1900 μs的間歇，使視網(wǎng)膜組織在長間歇中驅(qū)散積聚的熱量，從而避免細胞的凋亡[3]。微脈沖激光在RPE細胞中轉(zhuǎn)換及吸收的效果更佳，更易吸收黑色素及氧化血紅蛋白，在低能量的情況下便可起到治療作用，故更適合于黃斑區(qū)疾病的光凝治療[4]。現(xiàn)對微脈沖激光治療DME的可能機制、安全性及實際應用情況做一綜述。

一、作用機制

目前該機制尚未完全明確，研究顯示可能是通過改變視網(wǎng)膜細胞的代謝活性，進而改變基因和蛋白的表達。

(一)減輕視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞(retinal glial cells,RGC)的代謝活性

RGC的穩(wěn)態(tài)是調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血流、水平衡和維持屏障功能的前提條件[5，6]，在DR患者中，血管炎癥的最初表現(xiàn)就是RGC的激活，RGC是整個炎癥過程中的重要參與者。RGC主要包括小膠質(zhì)細胞(m glial cells,MGC)、Müller細胞和星形膠質(zhì)細胞，這些細胞在維持視網(wǎng)膜環(huán)境的穩(wěn)態(tài)方面起到重要的作用。微脈沖激光可以通過減輕RGC的代謝活性誘導視網(wǎng)膜炎性過程的下調(diào)來維護屏障功能以及水平衡。

1.Müller細胞 是連接于視網(wǎng)膜血管與神經(jīng)元的細胞，主要維持水與K+的穩(wěn)態(tài)，所以當Müller細胞出現(xiàn)功能障礙時便會造成液體的積聚，即黃斑水腫[7]。Midena等[8]發(fā)現(xiàn)微脈沖激光治療后，患者視網(wǎng)膜內(nèi)核層的厚度變薄，而Müller細胞主要分布在內(nèi)核層，故得出提示微脈沖可改善DME患者的Müller細胞的功能從而減輕DME癥狀。但并未有明確的證據(jù)。

2.降低膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達 在DR患者視網(wǎng)膜Müller細胞中GFAP的水平含量比較低，甚至不存在，而當GFAP表達增多時，象征著Müller細胞被激活[9]。相關(guān)研究顯示，血視網(wǎng)膜屏障(blood retinal barrier,BRB)發(fā)生破壞的這一過程與GFAP的表達增多相關(guān)[10]。綜上，我們推測，微脈沖激光可能通過使Müller細胞中GFAP的表達降低，進而使BRB的破壞減輕，滲出水腫減少。

3.恢復Kir 4.1的分布 Kir 4.1屬于跨膜蛋白的一種，可調(diào)節(jié)細胞外K+濃度，從而穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境。其主要定位于視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，而該特殊定位決定了調(diào)節(jié)K+濃度的準確性[11，12]。對于DR患者，Kir 4.1在Müller細胞中發(fā)生定位錯誤，失誤活性，減少細胞外K+濃度，從而Müller細胞水腫[13]，微脈沖激光治療可減輕黃斑區(qū)水腫可能與通過恢復Kir 4.1的正確定位有關(guān)。

4.調(diào)節(jié)Müller細胞源性血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)(MCD-VEGF)的表達 在視網(wǎng)膜的各個結(jié)構(gòu)中，Müller細胞與視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞釋放VEGF最多[14]。但相關(guān)研究報道，在糖尿病模型小鼠的視網(wǎng)膜中，Müller細胞分泌VEGF的量最高[15]。RPE細胞間的緊密連接離不開緊密連接蛋白-1(ZO-1)的作用[16]，另有研究證實，糖尿病模型小鼠的ZO-1逐漸被消耗掉，而這與MCD-VEGF相關(guān)[17]。有研究報道[18]，微脈沖激光治療的DME患者VEGF較之前明顯降低，盡管不清楚此處VEGF的源頭。Rodrigues等[19]研究表明，MCD-VEGF可促進Müller細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2的表達，并促使其活性增強，而MMP可促進毛細血管的滲漏，從而促進視網(wǎng)膜的水腫，微脈沖激光可能通過下調(diào)VEGF的表達而影響MMP-2的表達。

(二)對RPE細胞的刺激作用

當RPE細胞屏障功能發(fā)生破壞時，血管出現(xiàn)滲漏，進而導致DME。RPE細胞在具備屏障功能的同時，還可分泌VEGF、色素上皮衍生因子(pigrnent epithelium-derived factor,PEDF)、促血紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)等多種生長因子[20]。此外，還具有抗氧化、遷移分化等功能。目前普遍認為微脈沖激光是通過刺激RPE細胞，使之在重復的、短促的閾值下能量的刺激下被激活，開啟自我修復調(diào)節(jié)模式，從而促使水腫消退。但該過程的分子機制目前并不是非常明確，可能機制如下。

1.促進RPE細胞的增生與遷移 Tababat-Khani等[21]研究發(fā)現(xiàn)，對DME患者進行微脈沖激光治療，1 h之后患者視網(wǎng)膜RPE細胞的增生能力下降，而在24 h內(nèi)即恢復正常，接下來的幾天內(nèi)明顯提升，被直接照射及周邊附近的細胞均有該特點。也有研究報道[22]被微脈沖激光直接照射的RPE細胞較未被照射的部位數(shù)量少，但都具有細胞活性。因此推測，該治療方式可能損傷了RPE細胞，但是這種程度的損傷可能刺激了照射部位及附近的RPE細胞并促進了增生與遷移。

2.促進RPE細胞間緊密連接的恢復 Ji Cho[23]表明，在DME患者中，VEGF可促使ZO-1磷酸化，ZO-1磷酸化可上調(diào)Ⅳ型膠原蛋白的表達，從而可破壞RPE細胞屏障的完整性，而微脈沖激光是否可以直接修復ZO-1，目前不得而知，但是微脈沖激光可以抑制VEGF的表達，從而使ZO-1的損壞降低。

3.抗血管生成 視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜細胞之間正常生理功能的維持離不開抗血管生成因子(如PEDF)與促血管生成因子(如VEGF)的動態(tài)平衡。在DME患者中，長期的高血糖狀態(tài)嚴重破壞色素上皮細胞間的緊密性，打破PEDF和VEGF的平衡，增強血管的通透性，進而加重黃斑水腫。有研究顯示[24]對實驗小鼠的RPE細胞進行微脈沖照射之后，抗血管生長因子如PEDF等表達上升，促血管生長因子如VEGF等表達下降，促進兩者之間的動態(tài)平衡，從而減輕黃斑水腫。

4.影響EPO的分泌 EPO是一類可以促使RPE通透性降低的糖蛋白，此外，EPO可通過阻止ZO-1的磷酸化，維持RPE細胞的屏障功能，從而對視網(wǎng)膜具有保護作用[25]，被認為是RPE細胞的特殊標志物[26，27]。Midena等[27]研究顯示，微脈沖激光治療之后EPO的水平并未發(fā)生明顯改變，可能與樣本量及觀察時間有關(guān)。另有研究顯示，EPO在DME患者的早期可保護視神經(jīng)，但是到晚期卻會促進生成新生血管[28]。所以，有關(guān)微脈沖治療之后EPO的改變及對疾病的影響需要進一步探討。

5.上調(diào)熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)的表達 HSP在細胞的應激反應中表達比較廣泛，在細胞未完全破壞死亡時，可有效修復細胞的功能，幫助變性的蛋白復活。Inagaki等[29]研究顯示，微脈沖激光直接照射培養(yǎng)的RPE細胞，達到一定的時間時，細胞中的HSP70在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達增加，從而促進受損的RPE細胞修復，減輕炎癥反應，降低黃斑水腫。但是在人活體中是否完全一致尚未明確。

二、安全性

微脈沖激光的特征是激活細胞自身的生物修復功能，同時又不損壞RPE細胞。微脈沖激光的能量設(shè)置比較精準，作用于RPE層的同時卻又不會造成嚴重損害，一般不會損傷視網(wǎng)膜其它組織，不會產(chǎn)生肉眼可見的激光斑?？梢酝ㄟ^進行相干光層析成像術(shù)(optical coherence tomography,OCT)檢查來觀察橢圓體帶、嵌合帶、RPE層的結(jié)構(gòu)完整性，以此判斷是否操作正確。較傳統(tǒng)激光有明顯安全性優(yōu)勢，目前除因操作失誤造成的損害之外很少發(fā)現(xiàn)并發(fā)癥[30]。但不可因此便掉以輕心，在黃斑區(qū)的能量錯誤使用及重復治療均要謹慎以免造成不可逆損傷。目前大部分醫(yī)生在操作時會盡量避開中心小凹。

三、不同波長的閾值下微脈沖激光的差異

不同的色素對不同波長的光的吸收各不相同，血紅蛋白不吸收紅、紅外光，吸收綠、黃、藍光；葉黃素不吸收黃、紅、紅外光，對藍光吸收較多，綠光吸收較少；黑素色對藍、綠光吸收較多，黃、紅光吸收較少。此外，光的散射會隨波長變短而增多，造成的損害就會越大。532 nm激光波長屬于綠光，血紅蛋白可在該激光到達RPE層時將其吸收，所以，適用于眼底出血及血管性疾病方面的治療。577 nm波長屬于黃光，黃斑區(qū)網(wǎng)膜葉黃素的含量較高，對黃光的吸收率極低，而且黃光的穿透力較強，散射較小，毒性較低，故黃斑區(qū)域的病變較適合使用該激光。此外，黃光毒性低，散射小，且穿透力較綠光強。810 nm激光的波長接近紅外光譜，穿透性較好，可直達RPE層及脈絡(luò)膜，更適合運用于脈絡(luò)膜血管相關(guān)的疾病[31]。

四、方法及參數(shù)選擇

開始治療前，首先測定閾能量。將微脈沖激光儀器模式調(diào)整為連續(xù)波，曝光時間：0.05～0.20 s，光斑直徑：100～200 μm。選擇在后極部正常視網(wǎng)膜(血管弓以外)測定閾能量，能量從100 mW開始，逐漸增加(可10 mW增量)至隱約可見該處視網(wǎng)膜顏色發(fā)白，這時的能量設(shè)置為閾能量P值，之后將機器模式調(diào)整為微脈沖，選擇負載系數(shù)的5%～30%，閾能量P值的20%～30%，余設(shè)置不變，在需要治療的病變處和周圍施行微脈沖激光光凝治療[32]。Luttrull等[33]研究顯示當選擇負載系數(shù)的5%時，縮小光斑的直徑，可以使能量的擴散達到最大化，堆積的熱量至最小化。將模式調(diào)整為高密度時，可提高療效。Desmettre[34]發(fā)現(xiàn)參數(shù)設(shè)置為30%的閾能量P值時，通過熒光素眼底血管造影(fundus fluroresein angiogrpahy,FFA)檢查并未發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜組織的損傷；若繼續(xù)增加能量，便可出現(xiàn)組織損傷的現(xiàn)象。需要特別注意的是，微脈沖激光光凝治療參數(shù)目前尚未標準化，參數(shù)的設(shè)置因人因病而異，過高過低均不合適(過高傷及組織，過低作用不佳)。盡管目前有諸多經(jīng)驗，但微脈沖激光治療的參數(shù)設(shè)置仍未標準化，如何最大化提高療效并降低損傷需要繼續(xù)研究。

五、在DME中的應用

在DME的治療方案中，F(xiàn)riberg等[35]于1997年第一次使用了微脈沖激光，在之后的研究中顯示[36]，與傳統(tǒng)格柵激光光凝相比，微脈沖激光在DME的治療中的確存在療效優(yōu)勢。Vujosevic等[37]表示微脈沖激光在中度DME患者的治療中能保持穩(wěn)定的視功能。Venkatesh等[38]表示，微脈沖激光較傳統(tǒng)激光更好地維持了電生理的檢查指標，并提高了患眼的對比敏感度。Inagaki等[39]發(fā)現(xiàn)微脈沖激光能有效降低DME水腫并保持穩(wěn)定的視力。Moisseiev等[40]在相關(guān)研究中得出結(jié)論：微脈沖激光聯(lián)合抗VEGF眼內(nèi)注藥可有效縮減注藥次數(shù)，減輕手術(shù)風險及患者經(jīng)濟壓力。在如何更好地與抗VEGF藥物聯(lián)合方面也有學者做了詳細的研究。Citirik[41]表示當患者黃斑中心凹厚度(CMT)<300 μm時選擇微脈沖激光治療效果更理想，而當CMT>400 μm或者視力很差時則首選玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF制劑，或者選擇二者聯(lián)合治療。Moisseiev等[40]、Mansouri等[42]指出，當CMT<400 μm或者最佳矯正視力較好時，即針對輕中度DME患者，選擇微脈沖激光治療，半年之后若無改善，則應進行抗VEGF藥物治療。Lavinsky[43]發(fā)現(xiàn)微脈沖激光模式選擇方面，高密度比普通模式更有利于功能的恢復。隨著這一技術(shù)的廣泛應用，國內(nèi)學者[44]也做了相關(guān)研究，結(jié)論與上述相符。所以，在DME的治療中，大多數(shù)醫(yī)生認為，單純微脈沖激光適用于輕中度DME的治療，而重度DME則需要進行抗VEGF或兩種治療方式聯(lián)合，以便達到更好的治療效果。