人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞異檸檬酸脫氫酶1基因轉(zhuǎn)染條件的建立和驗(yàn)證

丁楠，蘇婷，許琳婧

（1.大連市公共衛(wèi)生臨床中心檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116033；2.大連市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116000）

膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性腦腫瘤類型，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的組織病理學(xué)和臨床標(biāo)準(zhǔn)，膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級[1]。WHO第Ⅳ級腫瘤（膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）是最具侵襲性的腫瘤，預(yù)后不佳[2-3]。最近一項(xiàng)全基因組分析[4]發(fā)現(xiàn)，在約12%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，異檸檬酸脫氫酶1基因（IDH1）的132密碼子處存在體細(xì)胞突變。16密碼子在6個繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中也發(fā)現(xiàn)這些突變，提示IDH1突變可能發(fā)生在低級別膠質(zhì)瘤形成后，并推動腫瘤向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)展。近年來，很多學(xué)者對IDH1基因突變在腫瘤發(fā)生中的作用進(jìn)行深入研究[5]。本研究利用轉(zhuǎn)染技術(shù)，對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞進(jìn)行IDH1基因過表達(dá)，建立適用于U251細(xì)胞IDH1過表達(dá)的最佳轉(zhuǎn)染方案，并通過篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的IDH1過表達(dá)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系，以期為后續(xù)針對膠質(zhì)瘤細(xì)胞IDH1突變的各種研究奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系購自上海子實(shí)生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA（美國Gibco公司）；PBS緩沖液、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗（美國HyClone公司）；抗生素G418二硫酸鹽（美國Sigma-Aldrich公司）；jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑（法國Polyplus-transfection公司）；IDH1 Human Mutant ORF Clone、pCMV6-Entry Tagged Cloning Vector、Anti-DDK（FLAG）單克隆抗體（美國Origene公司）；RNAiso Plus、Primer-Script RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex Taq（Tli RnaseH Plus，日本Takara公司）；氯仿、甘氨酸（中國國藥試劑公司）；異丙醇、無水乙醇、甲醇（中國科密歐公司）；Tris、SDS（中國Solarbio公司）；SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒（中國Biosharp公司）；BCA蛋白定量試劑盒、蛋白電泳Marker（美國Thermo公司）；PVDF膜（0.22μm，德國Millipore公司）；脫脂奶粉（中國伊利公司）。

采用三氣二氧化碳培養(yǎng)箱、超純水儀、倒置顯微鏡、臺式冷凍大容量離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、超凈工作臺、PCR擴(kuò)增儀、蛋白電泳槽、半干轉(zhuǎn)印槽、酶標(biāo)儀、微量蛋白核酸分析儀、pH儀、電子分析天平。實(shí)驗(yàn)所需要的引物，由Takara公司合成，見表1。

表1 PCR引物Table1 PCRPrimer

1.2 方法 DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)基（500 ml）：500 ml DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50 ml 10%胎牛血清+10 ml 2%青霉素/鏈霉素溶液，充分混勻，4℃保存?zhèn)溆?。Western blot電泳緩沖液（1 L）：25 mmol/L Tris 3.029 g+190 mmol/L甘氨酸14.263 g+0.1%SDS 1 g加入800 m1去離子水中攪拌溶解，調(diào)整pH至8.3，定容至1 L。Western blot轉(zhuǎn)移緩沖液（半干轉(zhuǎn)1 L）：48 mmol/L Tris 5.815 g+39 mmol/L甘氨酸2.928 g+200 ml 20%甲醇+0.04%SDS 0.4 g，加入至800 m1去離子水中攪拌溶解，容量瓶定容至1 L。TBS緩沖液（1 L）：3 g Tris+8 g NaCl+0.2 g KCl，加入至800 ml蒸餾水，pH調(diào)至7.4，再加水定容至1 L。TBS-T緩沖液：1×TBS+0.1%Tween-20。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 按照實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范培養(yǎng)細(xì)胞，操作過程避免細(xì)胞污染，如進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)前打開紫外線燈照射臺面30 min。按步驟加入試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，傳代前觀察待傳代細(xì)胞的生長狀態(tài)及形態(tài)，使用EDTA胰酶使貼壁細(xì)胞變圓脫壁。

1.3.2 G418篩選濃度確定 300 mg G418加入3 ml PBS溶液，濃度為100 mg/ml，完全溶解后，0.22μm過濾，-20℃環(huán)境下保存。用DMEM完全培養(yǎng)基將G418稀釋為0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 mg/L。96孔板接種細(xì)胞，每孔200μl含G418完全培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)4個平行，含G418培養(yǎng)基需現(xiàn)用現(xiàn)配。將培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基吸除，PBS洗滌1次，每孔加入不同濃度篩選培養(yǎng)基，隔天更換1次篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，篩選出的濃度即為后續(xù)IDH1轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒（VCT）組細(xì)胞篩選及培養(yǎng)培養(yǎng)所需G418濃度。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 使用濃度為200μl jetPRIME緩沖液稀釋IDH1 HUMAN MUTANT ORFCLONE和pCMV6-ENTRY Cloning Vector。然后使用轉(zhuǎn)染液滴定細(xì)胞，4 h后使用G418篩選培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，24 h后再篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.3.4 RT-PCR法檢測mRNA mRNA提取嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟，離心取上清液。

1.3.5 微量蛋白核酸分析儀檢測RNA濃度 A260/A280可得到核酸的純度，DNA一般1.8～2.0，RNA一般為2.0，測定mRNA濃度及純度，符合要求方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 反轉(zhuǎn)錄、cDNA擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件 按照日本寶生物公司PrimerScript RTreagent Kit with gDNA Eraser和SYBRPremix Ex Taq（Tli RnaseH Plus）試劑盒說明書進(jìn)行，引物用無菌超純水復(fù)溶即可。

1.3.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 按要求稀釋好梯度的標(biāo)準(zhǔn)品和提取的蛋白，加入200μl工作液，37℃放置30 min，酶標(biāo)儀562 nm測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)吸光度值得蛋白濃度。采用4×SDSPAGELoading Buffer加入提取的蛋白樣本后，震蕩混勻，99℃5 min，煮沸變性后，置于冰上冷卻，即可電泳，樣品于-20℃環(huán)境下保存。按照說明書和目的蛋白分子量，配置12%SDS-PAGE膠。制備Working Solution，將其均勻的覆蓋整個膜，室溫靜置2 min，按照檢測儀器的使用方法操作，曝光條件根據(jù)每種條件每種抗體的曝光效果確定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Minitab 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 G418用于篩選IDH1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞株濃度的確定 G418完全培養(yǎng)基培養(yǎng)正常細(xì)胞14 d，U251細(xì)胞全部死亡所需要的最低濃度為300 mg/L。

2.2 兩組IDH1基因表達(dá)水平比較 IDH1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞表達(dá)IDH1基因高于空白質(zhì)粒組（VCT組），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組IDH1基因表達(dá)水平比較Figure1 Comparison of IDH1 gene expression levels between the two groups

2.3 兩組IDH1和標(biāo)簽DDK抗體蛋白表達(dá)比較DDK蛋白，兩組細(xì)胞均有表達(dá)；IDH1蛋白，IDH1轉(zhuǎn)染組表達(dá)IDH1更明顯，見圖2。

圖2 兩組IDH1和標(biāo)簽DDK抗體蛋白表達(dá)比較Figure 2 Comparison of the protein expression of IDH1 and tagged DDK antibodiesbetween the two groups

3 討論

IDH1（R132H）突變是膠質(zhì)瘤的重要預(yù)后預(yù)測因子和診斷標(biāo)志，具有重要的臨床意義。大部分Ⅱ、Ⅲ膠質(zhì)瘤均存在IDH1基因突變，這種突變通常雜合子點(diǎn)突變，影響132位點(diǎn)的氨基酸精氨酸，導(dǎo)致其天然酶活性的喪失和替代酶活性的增加（產(chǎn)生D-2-羥基戊二酸）[6-7]。有研究表明，IDH1 R132H在體內(nèi)外顯著降低已建立的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的侵襲性[8-10]。

本研究在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251中轉(zhuǎn)染IDH1過表達(dá)質(zhì)粒。通過增殖情況，選擇用于含質(zhì)粒細(xì)胞篩選的最適抗生素G418濃度，經(jīng)過G418篩選培養(yǎng)基，分別獲得IDH1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞株。本研究DDK標(biāo)簽抗體驗(yàn)證了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件的成功建立。IDH1轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒組U251細(xì)胞IDH1基因和蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染試驗(yàn)成功，為后續(xù)針對膠質(zhì)瘤細(xì)胞IDH1突變的各種研究奠定了基礎(chǔ)。