外泌體在糖尿病腎臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用研究進(jìn)展

白雨，刁宗禮，劉文虎

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100050）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球糖尿病患者超過4.15億，預(yù)計(jì)2040年將增長至6.42億[1]。近年來，我國糖尿病患病率逐年上升，約占全球糖尿病患者1/3[2]。糖尿病是一種復(fù)雜的異質(zhì)性的糖代謝性疾病，主要表現(xiàn)為血糖升高，可出現(xiàn)多尿、多飲、疲勞、體質(zhì)量減輕等典型癥狀，并可導(dǎo)致酮癥酸中毒或非酮癥高滲昏迷等急性并發(fā)癥[3]，慢性高血糖還可引起多器官或組織功能失調(diào)，包括心血管疾病、腎臟損傷、視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)病變，皮膚損傷等[4]。其中，糖尿病腎臟疾?。―KD）是糖尿病最常見且最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，30%～40%的糖尿病患者會(huì)發(fā)生DKD，最終發(fā)展為終末期腎病（ESRD），增加患者心血管事件、感染、住院和死亡的風(fēng)險(xiǎn)[5]，降低患者生存率，加重社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6]。DKD是以尿白蛋白排泄持續(xù)升高：尿白蛋白/肌酐比值（UACR）＞30 mg/g或估算腎小球?yàn)V過率（EGFR）持續(xù)降低：＜60 ml/（min·1.73 m2）為特征的糖尿病相關(guān)慢性腎臟病，其病理改變包括腎小球肥大、系膜區(qū)增寬、腎小球基底膜增厚、腎小管基底膜增厚及分裂、腎小球硬化、Kimmelstiel-Wilson結(jié)節(jié)形成、腎小管間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤等[5]。目前，DKD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[7]，需探尋其潛在治療靶點(diǎn)。外泌體（exosomes）是細(xì)胞分泌的囊泡，內(nèi)含有RNA、DNA、蛋白及脂類等多種生物活性物質(zhì)，可被運(yùn)輸至其受體細(xì)胞并介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊和信號傳導(dǎo)[8]。研究[9]證實(shí)，腎臟中內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞、系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等在高糖環(huán)境的刺激下可誘導(dǎo)外泌體異常分泌。由此可見，在腎臟中，由高糖刺激下不同細(xì)胞分泌的外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間信號溝通在DKD發(fā)展和腎功能降低中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10-11]。本文針對外泌體在DKD發(fā)病機(jī)制中的作用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的生成及調(diào)控 細(xì)胞外囊泡（EVs）是被脂質(zhì)雙分子層包裹的一些生物活性物質(zhì)的小泡，可根據(jù)直徑大小分為外泌體（直徑40～150 nm），微泡（＞150～1 000 nm）和凋亡小體（＞1 000 nm），外泌體及微泡統(tǒng)稱為非凋亡細(xì)胞外囊泡[12]。外泌體在分泌至細(xì)胞外前儲(chǔ)存于多泡體（MVBs）內(nèi)，隨后形成晚期內(nèi)體，最后與細(xì)胞膜融合后釋放至細(xì)胞外[13]。外泌體的產(chǎn)生和分泌過程十分復(fù)雜，其具體機(jī)制尚未完全明確。目前已知轉(zhuǎn)運(yùn)所需的核內(nèi)體分選復(fù)合體（ESCRT-III）形成螺旋，誘導(dǎo)囊泡出芽和分裂形成MVBs[14]，與病毒從宿主細(xì)胞內(nèi)釋放的方式相似[15]。而RAB11、RAB27A和RAB31等小GTP酶參與MVBs與細(xì)胞膜融合過程[16]。在p53蛋白的調(diào)控下，細(xì)胞骨架的激活可調(diào)控外泌體的胞吞和胞吐[17]。此外，神經(jīng)酰胺的形成在外泌體的形成過程中發(fā)揮重要作用，對外泌體內(nèi)的生物活性物質(zhì)發(fā)揮修飾作用[18]。

1.2 外泌體的作用方式 外泌體從母細(xì)胞脫落后可通過兩種方式發(fā)揮其生物學(xué)功能：一是與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合激活相應(yīng)的信號通路發(fā)揮作用[19]；二是通過膜融合、內(nèi)吞作用被受體細(xì)胞內(nèi)化后通過其內(nèi)含有的生物活性物質(zhì)發(fā)揮多種生物學(xué)作用，如抑制凋亡[20]、促進(jìn)炎癥[21]等。外泌體具體作用與細(xì)胞來源、靶細(xì)胞及微環(huán)境密切相關(guān)，不同的微環(huán)境及細(xì)胞來源可使外泌體的表面標(biāo)志物及內(nèi)容物具有一定特異性，這些外泌體被靶細(xì)胞攝取后可能導(dǎo)致特異的表型及功能改變[22]。此外，外泌體的攝取過程也會(huì)受到細(xì)胞因子的影響，如巨噬細(xì)胞激活后可分泌胰島素樣生長因子-1（IGF-1），促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對外泌體的吞噬[23]。

1.3 外泌體在DKD中的作用 研究[1]表明，外泌體與DKD的診斷、發(fā)病機(jī)制及治療關(guān)系密切。研究證實(shí)，糖尿病患者血清及尿液中外泌體與正常個(gè)體血清及尿液中外泌體存在差異，主要表現(xiàn)為外泌體中RNA水平差異，對外泌體RNA分析提示，miR-29c、miR-199-3p、miR-126、miR-770、miR-192、miR-126等可作為早期DKD潛在生物標(biāo)志物[24-25]。在發(fā)病機(jī)制方面，腎臟中腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等在病理狀態(tài)下通過外泌體進(jìn)行細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，造成靶細(xì)胞損傷，參與DKD的發(fā)生發(fā)展[26]。研究[27]發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）來源的外泌體可減輕高糖刺激的腎臟細(xì)胞及DKD動(dòng)物模型的腎臟損傷，提示MSC來源的外泌體可作為DKD潛在治療手段，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究[28-30]。

2 不同細(xì)胞來源的外泌體在DKD發(fā)生機(jī)制中的作用

2.1 巨噬細(xì)胞來源外泌體 研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞在DKD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。腎臟損傷可募集并激活巨噬細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子并與腎臟細(xì)胞相互作用。研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞在高糖刺激下外泌體產(chǎn)生增加[31]。Zhu等[32]在體外用高糖刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體刺激腎小球系膜細(xì)胞，導(dǎo)致系膜細(xì)胞活化增殖，細(xì)胞外基質(zhì)，如4型膠原（Col-IV）、纖連蛋白（FN）、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）分泌增加。向C57BL/6小鼠體內(nèi)注射高糖刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體后，腎臟病理可見系膜擴(kuò)張和增殖，免疫組織化學(xué)染色提示腎組織巨噬細(xì)胞浸潤和系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)沉積。研究發(fā)現(xiàn)，高糖刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）和Smad3的mRNA水平較對照組顯著升高，而用siRNA抑制巨噬細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)后，外泌體中的TGF-β1水平降低，系膜細(xì)胞增殖驗(yàn)證反應(yīng)減輕，提示高糖刺激巨噬細(xì)胞分泌的外泌體在體內(nèi)和體外通過TGF-β1/Smad3途徑激活腎小球系膜細(xì)胞[32]。Ding等[33]發(fā)現(xiàn)，在體外用高糖刺激后巨噬細(xì)胞分泌的外泌體刺激足細(xì)胞，可增加足細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生和炎癥激活。高糖刺激后巨噬細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)miRNA-21-5p的表達(dá)水平增高，降低足細(xì)胞中抗炎因子A20表達(dá)從而誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，這一機(jī)制在鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中也得到證實(shí)。高糖刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體不僅作用于足細(xì)胞、系膜細(xì)胞等腎臟細(xì)胞，還激活正常巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。Zhu等[31]發(fā)現(xiàn)，將高糖刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體加入正常巨噬細(xì)胞中使其激活并促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、TNF-α、IL-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)。將高糖刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生外泌體經(jīng)尾靜脈注射至正常小鼠體內(nèi)，可觀察到小鼠腎臟明顯的系膜擴(kuò)張和增殖，腎組織NF-κB表達(dá)水平升高，提示高糖處理的巨噬細(xì)胞分泌的可能激活巨噬細(xì)胞，并通過NF-κB p65信號通路加速腎損傷。

2.2 腎小管來源外泌體 腎小管損傷在DKD的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。腎小管上皮細(xì)胞在受到高糖刺激后發(fā)生一系列病理改變，并與其他細(xì)胞相互作用，加重腎臟損傷[34-35]。研究[36]證實(shí)，高糖環(huán)境下腎小管來源的外泌體可對腎臟細(xì)胞產(chǎn)生影響。

Jia等[36]研究發(fā)現(xiàn)，高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞HK-2后產(chǎn)生的外泌體刺激正常的腎小管上皮細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致其纖維化改變。而用長效胰高血糖素樣肽1（GLP-1）類似物艾塞那肽（Exendin-4）預(yù)處理高糖刺激的HK-2細(xì)胞后產(chǎn)生的外泌體刺激正常腎小管上皮細(xì)胞，可減少FN和1型膠原（Col-I）分泌，且Exendin-4可通過p53依賴方式降低HK-2細(xì)胞及外泌體內(nèi)miR-192，改善纖維化改變，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Exendin-4可通過抑制腎小管上皮細(xì)胞分泌miR-192改善高糖誘導(dǎo)纖維化。王東等[37]用高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞，收集腎小管上皮細(xì)胞來源的外泌體，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞分泌的外泌體可通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/NF-κB信號通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活和功能改變。Hu等[38]發(fā)現(xiàn)，高糖聯(lián)合醛固酮刺激腎小管上皮細(xì)胞HK-2產(chǎn)生的外泌體與腎臟腎纖維細(xì)胞共培養(yǎng)可加重成纖維細(xì)胞的激活和纖維化，miRNA測序發(fā)現(xiàn)，高糖聯(lián)合醛固酮刺激后HK-2細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中miR-196b-5p水平顯著增加，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-196b-5p可抑制細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2（SOCS2）表達(dá)并增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）磷酸化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞功能異常及纖維化。該研究還發(fā)現(xiàn)，DKD患者的血漿miR-196b-5p水平高于非DKD患者，并與蛋白尿濃度呈正相關(guān)。與非DKD患者相比，糖尿病患者的腎臟標(biāo)本中，主要位于腎小管上皮細(xì)胞的miR-196b-5p的表達(dá)增加。該研究提示腎小管上皮細(xì)胞外泌體來源的miR-196b-5p在DKD纖維化中發(fā)揮重要作用。Wen等[39]發(fā)現(xiàn)，在體外用高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體刺激成纖維細(xì)胞NRK-49F可導(dǎo)致其增殖、形態(tài)學(xué)改變和FN、α-SMA和Col-I大量產(chǎn)生。該研究對外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與正常外泌體相比，高糖刺激后腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體有22個(gè)差異表達(dá)蛋白，生物信息學(xué)分析提示，蛋白烯醇酶1（Eno1）的表達(dá)與DKD密切相關(guān)。該研究提示高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可促進(jìn)纖維化，與Hu等[38]研究結(jié)果一致。

Rab27a是調(diào)節(jié)外泌體分泌的關(guān)鍵因子[40]，抑制Rab27a的表達(dá)可使細(xì)胞外泌體的分泌減少50%～70%[22]。此外，Rab27a敲除可改善小鼠的炎癥反應(yīng)[41]。Li等[42]發(fā)現(xiàn)，高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)DKD小鼠腎組織和BSA刺激的HK-2細(xì)胞中，Rab27a、IL-6、TNF-α和COL-I的表達(dá)顯著增加。體外抑制Rab27a表達(dá)可減輕HK-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制Rab27a可減少腎小管上皮細(xì)胞富含miR-26a-5p的外泌體分泌，提高細(xì)胞內(nèi)miR-26a-5p濃度，并通過抑制陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控樣蛋白1（CHAC1）/NF-kB通路減輕DKD炎癥反應(yīng)[42]。

上述研究證實(shí)，高糖刺激腎小管細(xì)胞可增加外泌體分泌，并通過被靶細(xì)胞內(nèi)化，促進(jìn)腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)和纖維化，提示阻斷高糖環(huán)境下腎小管細(xì)胞外泌體的分泌及探究外泌體發(fā)揮損傷的作用機(jī)制，可為尋找DKD治療的靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

2.3 系膜細(xì)胞來源外泌體 DKD的病理改變包括細(xì)胞外基質(zhì)分泌過多及腎小球系膜擴(kuò)張，逐漸擴(kuò)張的系膜堵塞腎小球毛細(xì)血管導(dǎo)致腎小球組織完整性和腎功能受損，最終加劇腎小球纖維化和瘢痕形成[43]。Wang等[44]發(fā)現(xiàn)，高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，且高糖刺激后，腎小球系膜細(xì)胞分泌的外泌體中TGF-β1表達(dá)水平較對照組顯著增加，進(jìn)一步研究證實(shí)，腎小球系膜細(xì)胞來源外泌體通過TGF-β1/磷脂酰肌醇（PI3KAKT）通路導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，而小檗堿預(yù)處理足細(xì)胞可減輕上述損傷。Tsai等[45]發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠及2型糖尿病患者尿液中分離的外泌體miR-15b-5p水平升高，且與UACR水平正相關(guān)，同樣，體外高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞后miR-15b-5p水平升高，而miR-15b-5p可通過降低其靶蛋白BCL-2表達(dá)水平誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡，但該實(shí)驗(yàn)未進(jìn)一步提取系膜細(xì)胞來源外泌體進(jìn)行成分分析及其對靶細(xì)胞的影響。

2.4 內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體 腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是DKD發(fā)生最早的病理改變，可能通過旁分泌作用導(dǎo)致其他腎臟細(xì)胞損傷[46]。外泌體是內(nèi)皮細(xì)胞與腎臟其他細(xì)胞溝通的介質(zhì)。Wu等[47]發(fā)現(xiàn)，高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞后外泌體分泌增多，這些外泌體可被足細(xì)胞內(nèi)化，導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化和屏障功能障礙，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞分泌的外泌體中，TGF-β1和Wnt/βcatenin水平較對照組顯著增加，提示TGF-β1和Wnt/β-catenin可能與足細(xì)胞功能障礙相關(guān)。Wu等[48]研究還發(fā)現(xiàn)，高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞分泌的外泌體可通過TGF-β1/Smad3信號通路促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞中α-SMA表達(dá)、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌，提示高糖環(huán)境下腎小球內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體可激活腎小球膜細(xì)胞并促進(jìn)腎臟纖維化。

2.5 足細(xì)胞來源外泌體 足細(xì)胞損傷是DKD的典型病理改變之一，在DKD的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。Munkonda等[49]研究證實(shí)，損傷的足細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可通過p38 MAPK和CD36途徑刺激腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，提示足細(xì)胞來源的外泌體會(huì)作用于腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的病理變化。Su等[50]發(fā)現(xiàn)，高糖刺激足細(xì)胞后產(chǎn)生的外泌體可使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化。高糖刺激足細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)miR-221表達(dá)顯著增加，miR-221的靶蛋白Dickkopf相關(guān)蛋白2（DKK2）是Wnt信號通路抑制劑，miR-221表達(dá)升高可引起Wnt/β-catenin通路水平升高，促進(jìn)腎小管上皮轉(zhuǎn)分化。抑制miR-221可降低腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin表達(dá)水平，減輕細(xì)胞損傷。該研究提示高糖刺激后足細(xì)胞來源的外泌體通過microRNA-221介導(dǎo)DKD腎小管細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。

3 小結(jié)

DKD是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，在臨床中DKD患者腎活檢中發(fā)現(xiàn)的最經(jīng)典的病理改變?yōu)閺浡院徒Y(jié)節(jié)性系膜擴(kuò)張和腎小球基底膜增厚[51]。同時(shí)，腎小管間質(zhì)病變也參與疾病的發(fā)展，包括腎小管萎縮、間質(zhì)炎癥和腎小管間質(zhì)纖維化[35]，與腎功能喪失密切相關(guān)。因此，腎小球內(nèi)皮損傷、足細(xì)胞損傷、系膜細(xì)胞功能異常和腎小管間質(zhì)損傷等病理過程在DKD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

在糖尿病環(huán)境下，腎臟細(xì)胞間的相互作用機(jī)制尚未明確。外泌體是細(xì)胞間溝通的重要途徑，探究細(xì)胞間外泌體的信號傳遞對研究DKD的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。目前外泌體在DKD發(fā)生機(jī)制中的研究多與腎小管上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞相關(guān)，提示高糖或蛋白刺激后腎小管上皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞來源的外泌體會(huì)加重腎臟損傷，而內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞及系膜細(xì)胞相關(guān)的研究較少，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究外泌體在糖尿病腎小球病變中的作用。此外，目前大部分研究為體外實(shí)驗(yàn)，證實(shí)高糖刺激后腎臟細(xì)胞外泌體發(fā)揮的作用，需進(jìn)行相應(yīng)的在體實(shí)驗(yàn)以深入探究不同細(xì)胞來源的外泌體在DKD發(fā)病機(jī)制中的作用。