環(huán)脂蛋白20 調(diào)控組蛋白H2B 泛素化經(jīng)NF-κB信號(hào)通路對(duì)巨噬細(xì)胞遷移的影響

卞姝，張曼，劉巖，姜朝陽，陳紅

沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，沈陽110024

摘要：目的 探討環(huán)指蛋白20（RNF20）調(diào)控組蛋白H2B 泛素化（H2Bub）經(jīng)核因子-κB（NF-κB）途徑對(duì)巨噬細(xì)胞遷移的影響。方法 將培養(yǎng)好的巨噬細(xì)胞分為7 組，A 組（對(duì)照組）：培養(yǎng)48 h；B 組（ox-LDL 刺激組）：50 mg/mL ox-LDL 刺激巨噬細(xì)胞48 h；C 組（ox-LDL+oe-RNF20 轉(zhuǎn)染組）：oe-RNF20 轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；D 組（ox-LDL+pcDNA 轉(zhuǎn)染對(duì)照組）：pcDNA 轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；E 組（ox-LDL+SN50 干預(yù)組）：50 mg/mL ox-LDL 刺激巨噬細(xì)胞24 h 后再給予10 μg/mL 的SN50 處理24 h，共干 預(yù)48 h；F 組（ox-LDL+LY 294002 干預(yù)組）：50 mg/mL ox-LDL 刺激巨噬細(xì)胞24 h 后再給予10μg/mL 的LY 294002 處理24 h，共干 預(yù)48 h；G組（ox-LDL+p38干預(yù)組）：50 mg/mL ox-LDL 刺激24 h后再給予10μg/mL的p38，共干 預(yù)48 h。采用Transwell法觀察巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量，Western blotting 法檢測(cè)RNF20、H2B、H2Bub、NF-κB 及白細(xì)胞介素6（IL-6）表達(dá)。結(jié)果 在ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞中，與A組比較，B組RNF20蛋白表達(dá)、H2Bub/H2B降低，巨噬 細(xì)胞遷移數(shù)量增多，NF-κB和IL-6 蛋白表達(dá)增加（P 均＜0.01）。在RNF20 過表達(dá)細(xì)胞模型中，與B 組比較，C 組RNF20 蛋白表達(dá)、H2Bub/H2B 增加，NF-κB、IL-6 蛋白表達(dá)減少，巨噬 細(xì)胞遷移數(shù)量減少（P 均＜0.01）；D 組RNF20 蛋白表達(dá)、H2Bub/H2B、NF-κB、IL-6 無明顯改變，巨噬 細(xì)胞遷移數(shù)量無明顯改變（P 均＞0.05）。給予SN50（NF-κB 抑制劑）、SB 203580（p38 抑制劑）和LY 294002（PI3K 抑制劑）處理巨噬細(xì)胞后，與B 組比較，E、F、G 組RNF20 蛋白表達(dá)、H2Bub/H2B 無明顯改變（P 均＞0.05）；E組NF-κB、IL-6蛋白表達(dá)及巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量減少（P均＜0.01）；F、G組NF-κB、IL-6蛋白表達(dá)及巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量無明顯改變（P均＞0.05）。結(jié)論 RNF20減少，H2Bub減少，加劇 巨噬細(xì)胞遷移及炎癥反應(yīng)，促進(jìn) 了動(dòng)脈粥樣硬化的形成，此過 程經(jīng)NF-κB信號(hào)通路起作用。

關(guān)鍵詞：動(dòng)脈粥樣硬化；基因表觀遺傳學(xué)；組蛋白泛素化；環(huán)指蛋白20；核因子-κB；巨噬細(xì)胞遷移

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2022.10.014

中圖分類號(hào)：R543.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-266X（2022）10-0060-04

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是慢性炎性疾病。巨噬細(xì)胞向血管內(nèi)膜的遷移及炎癥反應(yīng)是AS 發(fā)生的重要環(huán)節(jié)［1］?；虮碛^遺傳學(xué)是指基因的表達(dá)被調(diào)控與修改，但脫氧核糖核酸（DNA）序列卻仍保持原來的狀態(tài)，產(chǎn)生可遺傳的變化［2］。組蛋白經(jīng)翻譯后的泛素化修飾是其重要一員，其錯(cuò)誤的修飾將導(dǎo)致人體結(jié)構(gòu)與功能異常，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生［3］。基因表觀遺傳學(xué)可能是AS的最新研究熱點(diǎn)［4］。組蛋白是染色質(zhì)中的重要成分，其含有大量堿性蛋白質(zhì)，與酸性DNA緊密結(jié)合［5］。組蛋白經(jīng)過泛素化或去泛素化等翻譯后修飾，會(huì)影響DNA 損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期以及炎癥反應(yīng)等過程［6］。環(huán)指蛋白20（RNF20）是組蛋白H2B泛素化（H2Bub）修飾過程中的泛素化鏈接酶。研究表明，在腫瘤壞死因子α（TNF-α）刺激的人乳腺上皮細(xì)胞MCF10A中，RNF20參與H2Bub調(diào)控，抑制炎癥相關(guān)基因激活［7］。2020年12月―2021年11月，我們通過ox-LDL 刺激構(gòu)建巨噬細(xì)胞炎癥遷移模型，探討RNF20 調(diào)控組蛋白H2Bub 修飾經(jīng)NF-κB 途徑參與巨噬細(xì)胞遷移及炎癥反應(yīng)過程，為AS的預(yù)防與治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系，購自中國(guó)豐暉生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、FBS、Hyclone 購自美國(guó)Gibco 公司；ox-LDL 購自廣州奕源生物科技有限公司；BCA 試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；SN50（NF-KB 抑制劑）購自上海西格生物有限公司；SB203580（P38 抑制劑）；LY294002（PI3K 抑制劑）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell 小室購自美國(guó)Conring 公司；anti-RNF20 一抗、anti-IL-6 一抗、anti-H2B 一抗、anti-NF-κB 一抗、anti-β-actin 一抗、HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體均購自美國(guó)Abclonal 公司；anti-H2Bub 一抗購自美國(guó)CST 公司；RNF20 過表達(dá)載體質(zhì)粒oe-RNF20 及相應(yīng)的對(duì)照質(zhì)粒pcDNA 購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有10%FBS、1%的青鏈霉素，置于溫度37 ℃、含有5%CO2的細(xì)胞恒溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且密度達(dá)到80%左右，用PBS沖洗，胰蛋白酶消化完全后進(jìn)行傳代，傳至6～10代的RAW264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至生長(zhǎng)狀態(tài)良好且密度達(dá)80%左右時(shí)，棄含有血清的培養(yǎng)基，用PBS溶液沖洗。用Opti-MEMI 分別將LipofectamineTM3000、oe-RNF20、pcDNA混合均勻后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，6 h 后當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)到80%時(shí)，更換細(xì)胞培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染結(jié)束后繼續(xù)用ox-LDL刺激48 h。

1.4 細(xì)胞分組及干預(yù) 將細(xì)胞隨機(jī)分為7 組，A 組（對(duì)照組）：培養(yǎng)48 h；B 組（ox-LDL 刺激組）：應(yīng)用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；C 組（ox-LDL+oe-RNF20轉(zhuǎn)染組）：oe-RNF20 轉(zhuǎn)入巨噬細(xì)胞后用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；D 組（ox-LDL+pcDNA 轉(zhuǎn)染對(duì)照組）：pcDNA 轉(zhuǎn)入巨噬細(xì)胞后用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；E 組（ox-LDL+SN50 干預(yù)組）：應(yīng)用50 mg/mL的ox-LDL刺激24 h后再給予10μg/mL的SN50處理24 h，共干預(yù)48 h；F組（ox-LDL+LY294002干預(yù)組）：應(yīng)用50 mg/mL的ox-LDL刺激24 h后再給予10μg/mL的LY294002處理24 h，共干預(yù)48 h；G組（ox-LDL+p38干預(yù)組）：應(yīng)用50 mg/mL的ox-LDL刺激24 h后再給予10μg/mL的p38，共干預(yù)48 h，采樣檢測(cè)。

1.5 RNF20、H2B、H2Bub、NF-κB、IL-6 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。提取不同組的細(xì)胞蛋白，使用BCA法測(cè)量不同組間的蛋白濃度。取30μg的上樣量進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉2 h，加入用TBST 配置好的一抗，4 ℃過夜，洗膜3 次，每次8 min。然后加入用TBST 配置的二抗，在室溫下?lián)u晃40 min，再次洗膜3次，每次8 min。最后使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色，使用Image J 進(jìn)行灰度值分析與計(jì)算，測(cè)量3次后取平均值。

1.6 巨噬遷移能力檢測(cè) 采用Transwell 實(shí)驗(yàn)。按照Transwell 說明書，將密度達(dá)到50%的巨噬細(xì)胞用胰酶消化，制成適量濃度的細(xì)胞懸液后，取適量懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，在小室下室加含血清培養(yǎng)基，在小室上室加無血清的培養(yǎng)基并將細(xì)胞接種于小室上室。將含有細(xì)胞的小室培養(yǎng)48 h 后取出，用甲醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞染色，PBS 溶液進(jìn)行清洗。最后清除未穿過小室的細(xì)胞，置于顯微鏡觀察并拍照。每組細(xì)胞分別接種于3 個(gè)小室，平均值即細(xì)胞遷移數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以-x±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q法，兩組比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理各組巨噬細(xì)胞蛋白表達(dá)及巨噬細(xì)胞遷移變化 見表1。

表1 各組蛋白表達(dá)及遷移細(xì)胞數(shù)比較（-x±s）

2.2 上調(diào)RNF20 對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥及遷移影響 與A 組比較，B 組RNF20 蛋白表達(dá)減少（P＜0.01），H2Bub/H2B 減小（P＜0.01），NF-κB 和IL-6 蛋白表達(dá)增加（P均＜0.01），巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量增多（P＜0.01）；與B 組比較，C 組RNF20 蛋白表達(dá)增加（P＜0.01），H2Bub/H2B 增加（P＜0.01），NF-κB、IL-6 蛋白表達(dá)減少（P均＜0.01），巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量減少（P＜0.01）；D組RNF20蛋白表達(dá)、H2Bub/H2B、NF-κB、IL-6 蛋白表達(dá)、巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量與B 組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.3 RNF20 介導(dǎo)的H2Bub 經(jīng)NF-κB 途徑對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥及遷移影響 E、F及G 組RNF20蛋白表達(dá)與B組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），H2Bub/H2B 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），E 組NF-κB、IL-6蛋白表達(dá)減少（P均＜0.01），巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量減少（P＜0.01），F(xiàn)、G 組NF-κB、IL-6 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

AS是心腦血管疾病最常見的病理學(xué)基礎(chǔ)，其引發(fā)的心肌梗死及中風(fēng)等并發(fā)癥是最常見的死因［8］。巨噬細(xì)胞是參與AS發(fā)病的重要細(xì)胞之一，不僅能吞噬脂類物質(zhì)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的分泌，導(dǎo)致AS 斑塊的形成，還能結(jié)合活化的內(nèi)皮細(xì)胞并遷移到內(nèi)膜層，從而加重AS 病變過程［9］。組蛋白泛素化在基因轉(zhuǎn)錄后的修復(fù)過程和調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色，是基因表觀遺傳學(xué)的重要成員［10］?；虮碛^遺傳學(xué)已成為AS 新的研究領(lǐng)域［4］，AS 除了與脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng)等有關(guān)外，基因表觀遺傳學(xué)也參與其中［11］。

本研究觀察發(fā)現(xiàn)，在ox-LDL 刺激的巨噬細(xì)胞中，與對(duì)照細(xì)胞相比，ox-LDL 巨噬細(xì)胞遷移數(shù)目增多，且伴有RNF20 和H2Bub 的降低，提示在AS 形成過程中，組蛋白泛素化酶RNF20 減少，使H2Bub 表達(dá)減少，經(jīng)組蛋白修飾表觀遺傳學(xué)促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移。研究表明，RNF20 調(diào)控H2Bub 影響慢性炎癥及癌癥進(jìn)展，如在肺癌和卵巢癌中RNF20 及H2Bub 表達(dá)降低［12-13］，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

基因表觀遺傳學(xué)研究?jī)?nèi)容主要包含DNA 甲基化和組蛋白修飾等［14］。組蛋白是真核生物染色體的結(jié)構(gòu)蛋白，分為組蛋白H1（H1）、組蛋白H2A（H2A）、組蛋白H2B（H2B）、組蛋白H3（H3）和組蛋白H4（H4）五種。真核細(xì)胞中的DNA 以染色質(zhì)的形式存在，染色質(zhì)的基本組成單位是核小體，核小體由8個(gè)核心組蛋白（兩個(gè)H2A、H2B、H3、H4）和145～147個(gè)DNA 堿基對(duì)組成，H1 結(jié)合于核小體之間的連接DNA 上，使核小體緊密相連［15］。核小體中的核心處于比較穩(wěn)定的狀態(tài)，組蛋白的C 末端和N 末端可伸展到核小體外，發(fā)生泛素化等修飾［16］。組蛋白經(jīng)過泛素化修飾后使染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，影響了其與下游蛋白的相互作用，此外還可與甲基化及乙酰化等修飾協(xié)同作用，共同調(diào)控人體精細(xì)的生命活動(dòng)［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL 刺激的巨噬細(xì)胞中RNF20 及H2Bub 表達(dá)降低，這提示RNF20 可能修改H2Bub 修飾基因表觀遺傳學(xué)從而影響ox-LDL 刺激的巨噬細(xì)胞遷移。本研究結(jié)果表明，在過表達(dá)RNF20 后，H2Bub 表達(dá)增加，NF-κB 和IL-6 表達(dá)被抑制，且巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量減少，提示RNF20 可影響組蛋白H2Bub 基因表觀遺傳學(xué)，從而對(duì)巨噬細(xì)胞遷移及炎癥因子進(jìn)行調(diào)控。

此外本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在ox-LDL 刺激的巨噬細(xì)胞中NF-κB 和IL-6 表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在ox-LDL的巨噬細(xì)胞炎癥遷移模型中，加入多種炎癥通路的特異性抑制劑。結(jié)果顯示RNF20 及H2Bub 表達(dá)量無明顯改變，在加入NF-κB 通路抑制劑SN50 后，IL-6 表達(dá)下降且伴有巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量減少，而在加入SB203580（p38 通路抑制劑）和LY294002（PI3K通路抑制劑）并未觀察到這種改變。說明NF-κB 是H2Bub修飾基因表觀遺傳學(xué)參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)及巨噬細(xì)胞遷移的必經(jīng)途徑。NF-κB 是核轉(zhuǎn)錄因子，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［18］。NFκB 在正常血管中含量極低，在AS 中的巨噬細(xì)胞中NF-κB 含量明顯增高，表明NF-κB 參與AS 的調(diào)控［19］。NF-κB 信號(hào)通路能夠活化TNF-α、IL-6、IL-8等細(xì)胞炎性因子的表達(dá)從而加重炎癥反應(yīng)［20］。

綜上所述，組蛋白的泛素化作為基因表觀遺傳學(xué)的重要組成部分調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥及遷移反應(yīng)，進(jìn)而影響AS 的形成和發(fā)展。當(dāng)RNF20 減少時(shí)，H2Bub減少，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移及炎癥因子表達(dá)，從而促發(fā)AS 進(jìn)展，此過程經(jīng)過NF-κB 途徑發(fā)揮作用。