芍藥湯對(duì)胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜核因子—κB DNA結(jié)合活性的影響

羅敏++++++李帥軍++++++胡響當(dāng)++++++王曉艷++++++林仁敬++++++楊周雨

[摘要] 目的 研究芍藥湯對(duì)胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠核因子-κB（NF-κB）DNA結(jié)合活性的影響。 方法 將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常組，模型組，芍藥湯組，柳氮磺胺吡啶（SASP）組。制備胃腸濕熱型模型，然后采用三硝基苯磺酸（TNBS）制備灌腸法潰瘍性結(jié)腸炎模型，灌胃治療10 d后處死大鼠，取新鮮結(jié)腸黏膜標(biāo)本提取核蛋白，利用以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）為基礎(chǔ)的Trans AMTM NF-κB P65試劑盒檢測(cè)各組NF-κB相對(duì)活性。 結(jié)果 與正常組比較[（0.263±0.041）]，模型組大鼠NF-κB相對(duì)活性明顯增高[（0.467±0.083）]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型組比較，芍藥湯組大鼠結(jié)腸黏膜NF-κB相對(duì)活性明顯降低[（0.271±0.089）]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 芍藥湯能明顯降低胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型結(jié)腸黏膜NF-κB相對(duì)活性，可能是其治潰瘍性結(jié)腸炎作用的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 芍藥湯；胃腸濕熱；潰瘍性結(jié)腸炎；核因子-κB

[中圖分類(lèi)號(hào)] R574.62；R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）01（c）-0004-03

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚未明確，其中免疫因素在此病中所起的作用越來(lái)越受重視，研究已深入到細(xì)胞分子水平，特別是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）調(diào)控著UC患者中細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附分子（cell adhesionmolecules，CAM）的釋放，從而參與了UC腸道的炎癥和免疫反應(yīng)。芍藥湯出自《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集》，具有清熱燥濕、調(diào)氣和血的功效，根據(jù)多年的臨床研究，對(duì)于胃腸濕熱型UC，具有良好的療效，為求進(jìn)一步明確芍藥湯干預(yù)UC調(diào)節(jié)作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)NF-κB的DNA結(jié)合活性，從基因水平探討芍藥湯干預(yù)UC的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠40只，體重180～220 g，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[合格證號(hào)：SCXK（湘）2011～0003]，動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

核蛋白提取試劑盒（武漢博士德生物公司）；BCA-100蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒（西安晶彩生物科技有限公司）；Tarns AMTM NF-κB酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（上海齊一生物物技有限公司）；ZFMQ050PE型超純水器（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）；3K-30Z型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照藥物與試劑

柳氮磺胺吡啶（SASP）（上海福達(dá)制藥有限公司，批號(hào)：201310001，每片0.25 g），三硝基苯磺酸（TNBS）（Sigma公司），藥物用蒸餾水配成50 g/L。

1.4 實(shí)驗(yàn)用藥的制備

芍藥湯超微顆粒由芍藥、當(dāng)歸、黃連、檳榔、木香、黃芩、大黃、肉桂、甘草9味藥組成。組方超微顆粒由湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司提供，然后在湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院制劑科，將藥物用蒸餾水制成含生藥1.32 g/mL水劑。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 造模及分組 將40只大鼠隨機(jī)分為4組，每組各10只，正常組、模型組、芍藥湯組、SASP組。除正常組外，其余3組首先參考文獻(xiàn)[1-2]復(fù)制胃腸濕熱模型：以高脂高糖飲食飼養(yǎng)大鼠，即在普通飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，加用200 g/L蜂蜜水自由飲用，每隔1 d按大鼠體重灌服油脂10 g/kg，并與油脂一起灌服10 mL/kg白酒，共10 d。然后再放入溫度（32±2）℃，相對(duì)濕度為95%的人工氣候箱中，共5 d。待胃腸濕熱型模型造模成功后，再予以TNBS灌腸法制作UC大鼠模型。造UC模型前予禁食24 h，除正常組，其余各組大鼠先用乙醚麻醉，然后從肛門(mén)將大鼠灌胃針頭輕輕插入，避免損傷腸道，深度約為8 cm，推入TNBS溶液（含25 mL/L TNBS和500 mL/L乙醇）4 mL/kg體重，捏緊肛門(mén)平放5 min即可，術(shù)后予以常規(guī)飼養(yǎng)。待造模4 d后，隨機(jī)從每組中抽出1只處死并解剖，游離其結(jié)腸組織，用生理鹽水洗凈后，觀察距肛門(mén)7～8 cm處見(jiàn)肉眼可辨潰瘍面，病理檢查發(fā)現(xiàn)充血、水腫、隱窩膿腫和典型的潰瘍等形成，確定造模成功。

1.5.2 給藥方法與標(biāo)本留取 確定造模成功后第2天，將大鼠按體表面積折算成成人等效劑量給藥，芍藥湯組折算后為含生藥13.2 g/（kg·d），同理，SASP組折算后為0.5 g/（kg·d）。正常組和模型組大鼠用等體積量生理鹽水經(jīng)胃灌入。每組同時(shí)開(kāi)始按上述劑量給藥，1次/d，連續(xù)10 d。末次給藥24 h后，以脫頸椎法將大鼠處死，提取距肛門(mén)8 cm結(jié)腸組織，并沿縱軸剪開(kāi)，在結(jié)腸病變最明顯處取0.5 cm結(jié)腸，以10%甲醛液固定、石蠟包埋，制成病理切片，HE染色后光鏡下查看；余下部分刮取結(jié)腸黏膜組織，每只大鼠刮取50 mg新鮮結(jié)腸黏膜，立即提取核蛋白。利用以ELISA為基礎(chǔ)的Trans AMTM NF-κB P65試劑盒檢測(cè)各組NF-κB相對(duì)活性。

1.6 觀察指標(biāo)

①觀察大鼠的體重、大便、食欲、活動(dòng)度、精神狀態(tài)等；②結(jié)腸大體病理及組織學(xué)改變：觀察大鼠結(jié)腸黏膜的色澤、潰瘍、糜爛、等情況，觀察黏膜有無(wú)水腫、糜爛、潰瘍、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)等改變；③利用以ELISA為基礎(chǔ)的Trans AMTM NF-κB P65試劑盒檢測(cè)NF-κB的DNA結(jié)合活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

正常組大鼠體重、大便、飲食、活動(dòng)均正常。其余3組大鼠在造模后3 d內(nèi)均逐漸出現(xiàn)蜷縮、倦怠懶動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、拱背、便軟、便溏等癥狀，有的黏液便甚至可見(jiàn)肉眼血便。造模第4天每組隨機(jī)抽出一只處死后取結(jié)腸，除正常組外剩下各組結(jié)腸組織肉眼可見(jiàn)潰瘍面。芍藥湯組和陽(yáng)性對(duì)照組在用藥4 d以后，上述情況開(kāi)始逐漸改善，進(jìn)食量明顯增加，伴隨體重增加明顯，到用藥后期時(shí)，大便多呈顆粒狀，黏液便、血便等基本消失。模型組后期血便等癥狀有所改善，但大便仍不成形并大便臭穢。

2.2 結(jié)腸大體病理及組織學(xué)改變

正常組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，腺體結(jié)構(gòu)規(guī)則，各層次構(gòu)造清楚，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞及潰瘍（圖1 a，封三）。其余組所取結(jié)腸組織可見(jiàn)黏膜充血、水腫、糜爛、潰瘍，有的出現(xiàn)瘢痕形成，部分結(jié)腸擴(kuò)張、黏膜皺襞變淺，以模型組最為嚴(yán)重（圖1 b，封三）。SASP組和芍藥湯組病變明顯減輕，可見(jiàn)充血、水腫、糜爛和紅色瘢痕（圖1 c～d，封三）。

2.3 NF-κB 活性

與正常組比較，模型組大鼠NF-κB相對(duì)活性明顯增高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型組比較，芍藥湯組大鼠結(jié)腸黏膜NF-κB相對(duì)活性明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

3 討論

UC臨床上主要以腹瀉為主，排出含有血、膿和黏液的糞便，同時(shí)常伴有陣發(fā)性結(jié)腸痙攣性疼痛，并里急后重，排便后可獲緩解。本實(shí)驗(yàn)中的大鼠在采用TNBS造模成功后均出現(xiàn)腹瀉、黏液膿血便等癥狀，腸道主要表現(xiàn)為水腫、充血、糜爛，鏡下可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，在病理學(xué)和免疫學(xué)特征上與潰瘍性結(jié)腸炎病患者相似[3-6]。潰瘍性結(jié)腸炎是多種因素、多種機(jī)制相互作用的結(jié)果。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，各種細(xì)胞因子能夠相互作用形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，加重炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致黏膜損傷，這在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用[6-7]。

有研究表明，許多與炎癥和免疫反應(yīng)關(guān)系密切的趨化因子、黏附因子等重要因子均含有κB位點(diǎn)，活化的NF-κB能與特定的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)調(diào)節(jié)參與機(jī)體的炎癥和免疫有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，在機(jī)體的炎癥、免疫方面發(fā)揮重要作用[9-13]。NF-κB是可跟γ-球蛋白輕鏈基因的增強(qiáng)子GGGACTTTCC（B序列）結(jié)合的一種核蛋白，它在基因表達(dá)的先天免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖及分化中有重大作用，其中作為誘導(dǎo)UC發(fā)病的促炎因子如腫瘤壞死因子α、白介素6等，已被證實(shí)由核因子κB調(diào)節(jié)控制他們的轉(zhuǎn)錄水平，核因子κB的活化可以控制多種促炎因子的基因轉(zhuǎn)錄，這證明它在UC發(fā)病中的作用重大，UC發(fā)病時(shí)NF-κB呈過(guò)激活狀，放大炎性反應(yīng)[13-18]。

芍藥湯出自《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集》，具有清熱燥濕、調(diào)氣和血的功效。在臨床運(yùn)用中，針對(duì)胃腸濕熱型的UC能取得很好的治療效果。方中黃芩、黃連性味苦寒，入大腸經(jīng)，具有清熱燥濕解毒的功效，以除致病之因，為君藥。方中重用芍藥養(yǎng)血和營(yíng)、緩急止痛，再配以當(dāng)歸養(yǎng)血活血，體現(xiàn)了“行血?jiǎng)t便膿自愈”之義，且可兼顧濕熱邪毒熏灼腸絡(luò)，傷耗陰血之慮；木香、檳榔行氣導(dǎo)滯，“調(diào)氣則后重自除”，四藥相配，調(diào)和氣血，是為臣藥。大黃苦寒沉降，合芩連則清熱燥濕之功著，合歸、芍則活血行氣之力彰，其瀉下通腑作用可通導(dǎo)濕熱積滯從大便而去，體現(xiàn)“通因通用”之法。方以少量肉桂，其辛熱溫通之性，既可助歸、芍行血和營(yíng)，又可防嘔逆拒藥，屬佐助兼反佐之用。炙甘草和中調(diào)藥，與芍藥相配，又能緩急止痛，亦為佐使。諸藥合用，濕去熱清，氣血調(diào)和，故下痢可愈。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)芍藥湯治療過(guò)的胃腸濕熱型UC大鼠，其結(jié)腸NF-κB的表達(dá)顯著降低，可能是芍藥湯阻斷NF-κB的激活，減少NF-κB的活化誘導(dǎo)因素從而降低了NF-κB p65的表達(dá)，起到治療UC的作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 侯麗娟，唐方，王曉紅，等.潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立及影響因素[J].世界華人消化雜志，2011，19（31）：3242-3245.

[2] 徐陽(yáng)，唐艷萍.潰瘍性結(jié)腸炎中西醫(yī)動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2013，19（4）：469-472.

[3] 杜麗東，吳國(guó)泰，劉峰林，等.腸易激綜合征大鼠模型的復(fù)制與評(píng)價(jià)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2014，22（6）：43-48.

[4] 唐惠玲.NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)與疾病研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2012，35（5）：34-35.

[5] 盧健，范穎，馬驥，等.四逆散及不同配伍干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（16）：109-112.

[6] 盧健，馬驥，王麗娜，等.四逆散對(duì)實(shí)驗(yàn)性UC大鼠血TNF-α和IL-10的影響[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，33（6）：61-62.

[7] 賴明廣，王立生，姚君，等.TSP-2 2對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎NF-κB DNA結(jié)合活性和表達(dá)的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33（3）：428-431.

[8] 周婷婷，仝巧云.潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2012，21（12）：1163-1166.

[9] 鐘振東，蘇娟，韓麗，等.苦參素對(duì)潰瘍性結(jié)腸黏膜細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2012，2（4）：29-31.

[10] 冷芳，李弼民.核因子-κB對(duì)炎癥性腸病作用的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2012，6（9）：2444-2446.

[11] 黃曉燕，張濤，宋雅芳.溫腎降濁化瘀方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎CD14/TLR4-NF-κB通路的影響[J].世界華人消化雜志，2012，20（14）：1229-1233.

[12] 劉勝楠，盧雪峰，孫娜，等.Toll樣受體2、4及核因子-κB在潰瘍性結(jié)腸炎黏膜組織中的表達(dá)及臨床意義[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，50（2）：59-63.

[13] 華新宇，孔秀敏.阻斷交感神經(jīng)對(duì)大鼠腸道免疫屏障的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（4）：19-22.

[14] 項(xiàng)榮，胡艷，曹貝貝.β-Arrestins參與GPCRs信號(hào)通路的分子機(jī)制[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2013， 29（2）：122-127.

[15] 范恒，廖奕，陳小艷，等.潰瘍性結(jié)腸炎大鼠β2AR-β-arrestin2-NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及氧化苦參堿的干預(yù)作用[J].世界華人消化雜志，2010， 18（22）： 2308-2316.

[16] 余姚.中西藥聯(lián)用保留灌腸治療慢性潰瘍性結(jié)腸炎50例療效觀察[J].浙江中醫(yī)雜志，2012，47（6）：426.

[17] 沈群，陸菁，郭頌銘.針灸十字穴為主治療潰瘍性結(jié)腸炎療效觀察[J].上海針灸雜志，2012，31（5）：319-320.

[18] 華新宇，孔秀敏.阻斷交感神經(jīng)對(duì)大鼠腸道免疫屏障的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（4）：19-22.

（收稿日期：2014-10-19 本文編輯：蘇 暢）