新疆和田鵝源沙門(mén)氏菌血清型鑒定及耐藥性分析

鄭佳玉，肖海俠，程雪梅，艾柯代·吐魯洪，李鑌罡，張 毅，佟盼盼，蘇戰(zhàn)強(qiáng)

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

沙門(mén)氏菌血清型繁多，分布廣泛，是重要的人獸共患病的病原體[1]，可引起動(dòng)物的腸炎、菌血癥和腸外感染等急性或慢性疾病，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致患病動(dòng)物死亡[2-3]。沙門(mén)氏菌可以導(dǎo)致2～3 周齡的雛鵝大批死亡，致死率可達(dá)15%以上，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%[4]。沙門(mén)氏菌不僅對(duì)幼鵝有重大危害，還會(huì)對(duì)鵝蛋的孵化造成嚴(yán)重影響，可經(jīng)種鵝生殖道垂直傳播至鵝蛋中，導(dǎo)致許多雛鵝在孵化過(guò)程中就感染死亡，而攜帶沙門(mén)氏菌的鵝胚即使在孵化過(guò)程中存活，也會(huì)在出殼后幾天內(nèi)死去，成活率極低[5]。沙門(mén)氏菌抗原由菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（莢膜或包膜抗原）組成，依據(jù)這3 種抗原的組成不同，可將沙門(mén)氏菌分為不同的血清型[6]。截至2018 年，沙門(mén)氏菌已被確認(rèn)有血清型2 610種[7]。在沙門(mén)氏菌血清型中，鼠傷寒沙門(mén)氏菌致病性較強(qiáng)，禽類(lèi)感染后的發(fā)病率及死亡率最高[8]。在全球范圍內(nèi)，最常見(jiàn)的血清型是腸炎沙門(mén)氏菌，其次為鼠傷寒沙門(mén)氏菌。在發(fā)達(dá)國(guó)家中，流行的血清型以鼠傷寒沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌這兩種血清型為主。對(duì)英格蘭和威爾士的禽類(lèi)進(jìn)行沙門(mén)氏菌感染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染率在禽類(lèi)中位居第一，其次是雞白痢傷寒和腸炎沙門(mén)氏菌[9]。我國(guó)2006—2012 年分離的323 株禽源沙門(mén)氏菌以雞白痢、鼠傷寒和腸炎沙門(mén)氏菌為主要流行血清型，其中在鵝源沙門(mén)氏菌中占比較高的依次為鼠傷寒（11/66）、腸炎（10/66）、印第安納（10/66）和波茨坦（10/66）血清型[10]。2010—2015 年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆地區(qū)也以腸炎沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌為主要血清型[11]。

2018 年以來(lái)，新疆和田地區(qū)養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展迅速，但雛鵝的成活率一直非常低，初步懷疑是沙門(mén)氏菌導(dǎo)致的。目前關(guān)于新疆和田地區(qū)鵝源沙門(mén)氏菌的報(bào)道極少，因而該地區(qū)鵝源沙門(mén)氏菌流行血清型及其耐藥情況并不十分清楚。為了解新疆和田地區(qū)鵝源沙門(mén)氏菌血清型的分布特點(diǎn)及其耐藥性，采集兩個(gè)規(guī)?；B(yǎng)鵝場(chǎng)的病死鵝樣本進(jìn)行沙門(mén)氏菌分離、血清型鑒定和耐藥性分析，以期為和田地區(qū)鵝沙門(mén)氏菌病防控以及指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2021 年4 月，于新疆和田地區(qū)兩個(gè)規(guī)模化養(yǎng)殖鵝場(chǎng)，無(wú)菌采集不同日齡病死鵝內(nèi)臟及肛拭子樣本，放置于含有緩沖蛋白胨水（BPW）肉湯的4 mL EP 管中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。

1.1.2 主要試劑及儀器 BPW、RVS 肉湯、HE（Hektoen Enteric）瓊脂、SS 瓊脂、TTB 培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島海博生物科技有限公司；XLT4 瓊脂和配套試劑27%十四烷基磺酸鈉溶液，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基，購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；革蘭氏染色劑，購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；PCR 反應(yīng)相關(guān)試劑（2×TaqPCR Green Mix、ddH2O），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。TS-2102C 恒溫?fù)u床，購(gòu)自上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；SWCJ-2F 雙人雙面垂直潔凈工作臺(tái)，購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；GSX1 梯度PCR 擴(kuò)增儀，購(gòu)自美國(guó)Eppendorf 公司；DYY-6C 電泳儀，購(gòu)自北京市六一儀器廠(chǎng)；DYY-7C 型電泳儀，購(gòu)自北京市六一儀器廠(chǎng)；凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；高溫高壓滅菌鍋，型號(hào)HVE-50。

1.1.3 引物合成 參照文獻(xiàn)[12]設(shè)計(jì)沙門(mén)氏菌invA靶基因引物、多重血清型引物以及鼠傷寒型（TMP1、TMP2、TMP3）、霍亂型（CMP1、CMP2、CMP3）、嬰兒型（IMP1、IMP2、IMP3）、哈達(dá)爾型（HMP1、HMP2、HMP3）、腸炎型（EMP1、EMP2、EMP3）、都柏林型（DMP1、DMP2、DMP3）和雞傷寒型（GMP1、GMP2、GMP3）引物，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列信息詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

1.1.4 藥敏片 18 種藥敏片，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限責(zé)任公司，詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

表2 藥敏片信息

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及細(xì)菌培養(yǎng) 參照GB 47894—2016[13]沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，從預(yù)增菌的BPW 中吸取300 μL 菌液接種于3 mL RVS 增菌液中，42 ℃恒溫?fù)u床120 r/min 培養(yǎng)24 h；將RVS 培養(yǎng)物平板劃線(xiàn)接種HE 和SS 瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 分離菌株生化試驗(yàn) 在HE、SS 瓊脂平板上，挑選每個(gè)樣本區(qū)域中疑似沙門(mén)氏菌的單菌落置于RVS 肉湯中培養(yǎng)24 h，然后取20 μL 菌液接種于沙門(mén)氏菌成套生化鑒定管中，再挑取樣本對(duì)應(yīng)的單菌落穿刺于衛(wèi)矛醇半固體中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀(guān)察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 沙門(mén)氏菌PCR 鑒定 采用水煮法提取菌落DNA。挑取符合沙門(mén)氏菌生化鑒定結(jié)果的RVS 肉湯，將1 mL 菌液置于1.5 mL 離心管中，12 000 r/min離心3 min，棄上清液；加入1 mL無(wú)菌緩沖液，混勻，12 000 r/min 離心3 min，棄上清液（重復(fù)2 次）；加入200 μL 無(wú)菌Buffer 混勻后放入100 ℃的水浴中，12 000 r/min，離心1 min，收集并保存上清液作為PCR 模板。以疑似沙門(mén)氏菌的DNA 為模板，利用PCR 法擴(kuò)增沙門(mén)氏菌特異性invA基因；以沙門(mén)氏菌XJ-e7 菌株作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照，空白肉湯為陰性對(duì)照，檢測(cè)DNA 樣本中是否攜帶invA目的基因片段。PCR 總反應(yīng)體系為12.5 μL。PCR 運(yùn)行參數(shù)[12]：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)觀(guān)察并記錄結(jié)果。

1.2.4 血清學(xué)檢測(cè) 采用文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法，對(duì)7 種臨床常見(jiàn)沙門(mén)氏菌血清型進(jìn)行鑒別，參照該文獻(xiàn)中的PCR 反應(yīng)體系，擴(kuò)增沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣本。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠中電泳2 h，通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)觀(guān)察并記錄結(jié)果。

1.2.5 耐藥性檢測(cè) 采用CLSI 推薦的K-B 法，對(duì)分離到的沙門(mén)氏菌菌株進(jìn)行常規(guī)的18 種抗菌藥物敏感性檢測(cè)。挑取純化的單菌落2～3 個(gè)，接種于MH 肉湯中，37 ℃搖床培養(yǎng)12 h；調(diào)整菌懸液至0.5 麥?zhǔn)蠞岫?，用滅菌棉簽蘸取菌懸液，均勻且緊密地涂布在MH 平板上，室溫下放置5 min，藥敏片接觸平板后不得移動(dòng)；將MH 平板置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h 后，用標(biāo)尺測(cè)量并記錄抑菌圈直徑，根據(jù)CLSI（2016年版）標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。對(duì)3 種及以上抗菌藥物同時(shí)耐藥的菌株被確定為多重耐藥菌。

2 結(jié)果

2.1 沙門(mén)氏菌分離鑒定

培養(yǎng)基分離結(jié)果（圖1）、生化鑒定結(jié)果（圖2）和PCR 驗(yàn)證結(jié)果（圖3）顯示，在兩個(gè)鵝場(chǎng)樣本中共分離到14 株沙門(mén)氏菌，分離率為1.81%（14/773）。A 場(chǎng)：死亡鵝內(nèi)臟樣品的沙門(mén)氏菌分離率為1.33%（4/300），肛拭子的沙門(mén)氏菌分離率為1.66%（5/300），存活病鵝肛拭子中未分離出沙門(mén)氏菌，鵝樣本中的沙門(mén)氏菌總分離率為1.44%（9/625）。B 場(chǎng)：病死鵝內(nèi)臟樣品的沙門(mén)氏菌分離率為20.00%（4/20），肛拭子中未分離出沙門(mén)氏菌，存活病鵝肛拭子中的沙門(mén)氏菌分離率為0.91%（1/109），鵝樣本中的沙門(mén)氏菌總分離率為3.37%（5/148）。

2.2 沙門(mén)氏菌血清型

以分離到的14 株沙門(mén)氏菌DNA 為模版，經(jīng)PCR 檢測(cè)和16S rRNA 基因序列分析比對(duì)，鑒定其血清型。結(jié)果（圖4～5）顯示：有11 株沙門(mén)氏菌血清型鑒定成功，共包含4 種血清型，其中鼠傷寒沙門(mén)氏菌占42.86%（6/14），腸炎沙門(mén)氏菌占21.43%（3/14），德比沙門(mén)氏菌（登錄號(hào)YSJHNRTA016）占7.14%（1/14），紐蘭沙門(mén)氏菌（登錄號(hào)YSJSGXWF013）占7.14%（1/14）；剩余3株沙門(mén)氏菌，經(jīng)上述方法未能鑒定成功，無(wú)法辨別其血清型。在分離到的14 株沙門(mén)氏菌中，A 場(chǎng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌占11.1%（1/9），腸炎沙門(mén)氏菌占33.3%（3/9），德比沙門(mén)氏菌占11.1%（1/9），紐蘭沙門(mén)氏菌占11.1%（1/9）；B 場(chǎng)沙門(mén)氏菌血清型均為鼠傷寒沙門(mén)氏菌（5/5）。

2.3 沙門(mén)氏菌耐藥性

選取10 株沙門(mén)氏菌分離株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，10 株沙門(mén)氏菌均表現(xiàn)為對(duì)3 種及以上抗菌藥物同時(shí)耐藥（圖6），且全部對(duì)氨芐西林和鏈霉素耐藥。耐藥種數(shù)為13～15 種的沙門(mén)氏菌有5 株，占比為50%（5/10）；對(duì)10 種抗菌藥物同時(shí)耐藥的有2 株，占比為20%（2/10）；對(duì)3 種抗菌藥物同時(shí)耐藥的有1 株，占比為10%（1/10）；對(duì)4 種抗菌藥物同時(shí)耐藥的有2 株，占比為20%。

沙門(mén)氏菌分離株對(duì)18 種藥物呈現(xiàn)不同的耐藥性（圖7），其中對(duì)多黏菌素B 和哌拉西林-他唑巴坦的耐藥率為10%，對(duì)阿莫西林-棒酸和頭孢吡肟的耐藥率均為20%，對(duì)頭孢他啶的耐藥率為40%，對(duì)氨芐西林-舒巴坦的耐藥率為50%，對(duì)頭孢噻肟、氨曲南、慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、磺胺甲基異惡唑和氯霉素的耐藥率為60%～70%，對(duì)氨芐西林和鏈霉素的耐藥率均為100%。結(jié)果表明，沙門(mén)氏菌分離株對(duì)多黏菌素B、哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-棒酸和頭孢吡肟這4 種抗菌藥物較為敏感，而對(duì)其他10 種抗菌藥物均表現(xiàn)為耐藥，其中對(duì)氨芐西林和鏈霉素全部耐藥。

3 討論

不同國(guó)家或地區(qū)以及不同飼養(yǎng)管理模式下的沙門(mén)氏菌分離率存在著明顯差異。2017 年的一項(xiàng)研究[6]表明，鵝、鴨等水禽是沙門(mén)氏菌感染率較高的動(dòng)物之一。2006—2012 年我國(guó)12 個(gè)省7 個(gè)地區(qū)鵝中的沙門(mén)氏菌檢出率為12.4%，是被檢家禽種類(lèi)中沙門(mén)氏菌分離率最高的[14]。2013 年歐盟報(bào)告的鵝源沙門(mén)氏菌分離率為8.4%[15]，波蘭東南部鵝群中的沙門(mén)氏菌分離率為5%[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，和田地區(qū)鵝場(chǎng)沙門(mén)氏菌分離率（1.81%）高于德克薩斯州水禽分離率（0.5%），但低于安徽?。?4%）、山東?。?6%）和江蘇?。?1%）[6，17]，表明新疆和田地區(qū)兩鵝場(chǎng)與其他地區(qū)相比感染情況并不嚴(yán)重，與新疆地區(qū)近5 年研究報(bào)道的沙門(mén)氏菌陽(yáng)性率（1%～11%）[18-20]較為一致。

由于不同地區(qū)的環(huán)境氣候或者飼養(yǎng)管理存在差異等，各地區(qū)的沙門(mén)氏菌血清型流行情況也不同。本研究對(duì)兩鵝場(chǎng)分離出的沙門(mén)氏菌進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌（42.86%）為優(yōu)勢(shì)血清型，其次為腸炎沙門(mén)氏菌（21.43%），與我國(guó)監(jiān)測(cè)的散發(fā)性沙門(mén)氏菌感染中的常見(jiàn)血清型基本一致[21]。四川省鴨源鼠傷寒沙門(mén)氏菌占37.5%，腸炎型沙門(mén)氏菌占14.6%[22]，與本研究結(jié)果較為相似；華東地區(qū)報(bào)道的禽類(lèi)沙門(mén)氏菌優(yōu)勢(shì)血清型為雞白痢沙門(mén)氏菌[23]，與本研究結(jié)果有所不同。根據(jù)不同鵝場(chǎng)的樣本分析，A 場(chǎng)中腸炎沙門(mén)氏菌為優(yōu)勢(shì)血清型（33.3%），與美國(guó)（FoodNet）2013—2016 年公布的食源性沙門(mén)氏菌優(yōu)勢(shì)血清型基本一致[24]。A 場(chǎng)中流行的沙門(mén)氏菌血清型種類(lèi)較多，共有4種。而B(niǎo) 場(chǎng)血清型種類(lèi)單一，均為鼠傷寒沙門(mén)氏菌（100%），與我國(guó)新疆地區(qū)2010—2015 年發(fā)布的主要流行沙門(mén)氏菌血清型和歐洲報(bào)道的沙門(mén)氏菌優(yōu)勢(shì)血清型基本一致[25]。兩鵝場(chǎng)分離到的沙門(mén)氏菌優(yōu)勢(shì)血清型種類(lèi)差異較為明顯。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，A 場(chǎng)還存在德比沙門(mén)氏菌及紐蘭沙門(mén)氏菌這兩種血清型。因此，加強(qiáng)鵝場(chǎng)沙門(mén)氏菌監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)于沙門(mén)氏菌病預(yù)防和診治有十分重要的意義。

臨床上抗菌藥物的廣泛使用是沙門(mén)氏菌對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的重要原因。不同地區(qū)，即使同種抗生素也存在一定的耐藥性差異。2019 年江蘇省沙門(mén)氏菌藥敏結(jié)果顯示，沙門(mén)氏菌對(duì)氨芐西林和磺胺異惡唑耐藥率（42.5%）最高[26]；2017年安徽省鵝場(chǎng)沙門(mén)氏菌藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示，沙門(mén)氏菌對(duì)氨芐西林和鏈霉素耐藥[27]，與本試驗(yàn)的耐藥情況基本一致。本研究中，沙門(mén)氏菌分離株對(duì)多黏菌素B、哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-棒酸和頭孢吡肟較為敏感，耐藥率（10%～20%）較低，與遼寧省鵝源沙門(mén)氏菌對(duì)多黏菌素B 的敏感率[28]較為相似，但其他抗菌藥物的藥物敏感度與本研究結(jié)果有所差異。新疆地區(qū)報(bào)道的雞源沙門(mén)氏菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率（83.8%）最高[29]，與本研究的環(huán)丙沙星耐藥率（60%）有明顯差異。四川、河南、廣西、廣東和江西5 個(gè)地區(qū)對(duì)動(dòng)物源沙門(mén)氏菌進(jìn)行了β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)藥敏試驗(yàn)[30]，發(fā)現(xiàn)分離的沙門(mén)氏菌菌株對(duì)第1 代頭孢類(lèi)藥物頭孢唑啉、第3 代頭孢類(lèi)藥物頭孢噻呋具有嚴(yán)重的耐藥性，同時(shí)對(duì)氨芐西林、阿莫西林、氨曲南等藥物也有耐藥性，而第2代頭孢類(lèi)藥物頭孢西丁、第3 代頭孢類(lèi)藥物頭孢曲松、第4 代頭孢類(lèi)藥物頭孢吡肟，對(duì)其有著較強(qiáng)的抑制作用，與本研究的沙門(mén)氏菌分離株對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)藥物中的氨芐西林、氨曲南、頭孢噻肟等的耐藥情況基本一致。

總體來(lái)說(shuō)，本研究中的沙門(mén)氏菌菌株對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物、喹諾酮類(lèi)藥物、青霉素類(lèi)藥物、磺胺類(lèi)藥物、四環(huán)素類(lèi)藥物以及氯霉素藥物均具有耐藥性，對(duì)部分β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗菌藥物以及多黏菌素B 敏感性較高。耐藥性的產(chǎn)生因素有很多，比如藥物使用情況、菌體自身情況以及所攜帶耐藥基因種類(lèi)等[31]。鵝場(chǎng)常用的抗生素藥物為頭孢噻呋和頭孢喹肟，均屬于β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素中的第3代頭孢類(lèi)藥物，與本研究中耐藥率較高的氨芐西林、頭孢噻肟和氯霉素同屬于β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)藥物，其中頭孢噻肟與頭孢喹肟和頭孢噻呋同屬于第3 代頭孢類(lèi)藥物，說(shuō)明鵝場(chǎng)使用的藥物對(duì)鵝場(chǎng)沙門(mén)氏菌菌株的耐藥性產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致鵝場(chǎng)沙門(mén)氏菌菌株的耐藥情況較為嚴(yán)峻。因此，在臨床上使用抗生素類(lèi)藥物時(shí)，要根據(jù)鵝場(chǎng)日常的用藥情況進(jìn)行具體分析。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)：新疆和田地區(qū)鵝源沙門(mén)氏菌流行的血清型較為復(fù)雜，其中鼠傷寒沙門(mén)氏菌為優(yōu)勢(shì)血清型，但不同養(yǎng)殖場(chǎng)流行的血清型種類(lèi)及優(yōu)勢(shì)血清型存在差異；流行的鵝源沙門(mén)氏菌耐藥較為普遍，且均為多重耐藥。因此，需要根據(jù)各場(chǎng)具體的流行血清型菌株情況，科學(xué)指導(dǎo)臨床中的抗菌藥物使用。