北京市1 株貓傳染性腹膜炎病毒的分離鑒定及遺傳進化分析

賈媛媛，吳宗霖，范玉華，周常喜，殷桂彬，宋 健，李 佳，姜代勛，陳 武

（1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.獸醫(yī)學(xué)中醫(yī)藥北京市重點實驗室，北京 102206）

貓傳染性腹膜炎（feline infectious peritonitis，F(xiàn)IP）是一種漸進性、高致死性疾病[1]，可發(fā)生在以幼貓和老年貓為主的各年齡段家貓，野貓和獵豹也是易感動物[2]。FIP的病原為貓冠狀病毒（FCoV）?；谂R床癥狀及產(chǎn)生的病理變化不同，F(xiàn)CoV 分為貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）和貓腸道冠狀病毒（FECV）兩個生物型[3-4]。FECV 在貓腸道中普遍存在，通常導(dǎo)致患貓出現(xiàn)輕微的腸道癥狀，一般能夠自愈，死亡率低。而感染 FCoV 的貓中，5%～12%將患上FIP[5]。

FIPV 在分類上屬于套式病毒目（Nidovirus）冠狀病毒科冠狀病毒屬，為單股正鏈、不分節(jié)段的RNA 病毒。FIPV 有4 種主要結(jié)構(gòu)蛋白，即刺突蛋白（S 蛋白）、膜蛋白（M 蛋白）、小包膜蛋白（E蛋白）和核衣殼蛋白（N 蛋白），以及5 種特異性輔助蛋白（3a、3b、3c 和7a、7b，以下簡寫為7ab）[6]。有研究[7]顯示，F(xiàn)IPV 和FECV 的區(qū)別很大程度上是由S、3c、7ab 蛋白基因發(fā)生突變引起的。為了掌握北京市FIPV 與國內(nèi)外毒株基因型之間的差異性，本研究對臨床FIP 陽性病例感染毒株進行了分離鑒定和不同基因分型序列分析，以期豐富我國FIPV 分子流行病學(xué)資料，為該病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床病料采集與處理

病料來自經(jīng)北京市動物醫(yī)院臨床診斷并確診為FIP 的新近死亡貓，或經(jīng)寵主遺棄后實施安樂死的患貓。

無菌采集患貓腹水樣品，一部分用本實驗室建立的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）進行病原檢測；另一部分經(jīng)離心（4 ℃，12 000 r/min，15 min）和過濾除菌（0.22 μm PES 濾器）后，分裝于無菌的1.5 mL EP 管中，用封口膜封口，置于-80 ℃冰箱備用。

無菌采集患貓各組織樣品（心、肝、脾、肺、腎、胃、腸管、氣管、食管、膀胱、眼、腦）1 g 于液氮中冷凍1～2 min 后，加入5 倍體積的PBS，充分研磨后離心（3 000 r/min，15～20 min）；在超凈臺上，取上清經(jīng)0.22 μm 濾器過濾除菌后分裝于無菌的1.5 mL EP 管中，用封口膜封口，置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 CRFK 細胞

CRFK 細胞系，由北京市中瑞動檢公司惠贈。

1.3 主要試劑和儀器

Solarbio 10×PBS、DMEM 高糖培養(yǎng)基（含青霉素、鏈霉素），Gibco 0.25%胰酶、胎牛血清（FBS），均購自北京愛普瑞晟科技有限公司。SteadyPure病毒DNA/RNA 提取試劑盒、SteadyPure 通用型RNA 提取試劑盒、一步法RT-PCR 試劑盒、Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×ProTaqDNA 聚合酶、DL 2 000 DNA Marker，均購自湖南艾科瑞科技公司（北京）。

主要儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱，Heal Force 公司產(chǎn)品；PCR 儀和電泳儀，BIO-RAD 公司產(chǎn)品；移液槍，Eppendorf 公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 病毒分離與細胞病變觀察

1.4.1 CRFK 細胞培養(yǎng) 將CRFK 細胞凍存管從-80 ℃冰箱中迅速取出，立即放入37 ℃水浴鍋中水浴，并輕輕晃動，待細胞凍存液全部融化后，使用酒精棉擦拭凍存管，將其快速轉(zhuǎn)移至超凈臺；于超凈臺上打開凍存管蓋，將液體全數(shù)轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，蓋緊，1 000 r/min，離心8 min；棄掉細胞上清后，加入1.0 mL 預(yù)熱的含10% FBS 的細胞培養(yǎng)液重懸，后轉(zhuǎn)移至內(nèi)含3.0 mL 預(yù)熱細胞培養(yǎng)液的T25 細胞瓶中，輕輕吹打混勻，使細胞均勻分布于細胞瓶底部；在含5% CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁（約12 h），觀察細胞是否處于正常生長形態(tài)。

1.4.2 病毒分離 參考文獻[8]的操作方法進行病毒接種，根據(jù)此株病毒特點進行適當(dāng)調(diào)整。具體分離過程：待CRFK 單層細胞貼壁80%～90%后，棄去舊培養(yǎng)基，消化，加入適量無血清培養(yǎng)基重懸；調(diào)整細胞密度為106個/mL，將處理好的FIP 陽性病料和細胞重懸液，按照體積比1:10 接種于六孔板中并設(shè)置陰性對照；將所有孔保持胰蛋白酶終質(zhì)量濃度為20 μg/mL，將六孔板置于細胞培養(yǎng)箱中吸附1 h，每隔15 min 輕微晃動；每天觀察細胞生長和病變情況，當(dāng)細胞病變（CPE）達到80%時收取病毒樣品，如沒有病變則進行盲傳，盲傳8 代后如仍沒有病變，則視為陰性。

1.5 RT-PCR 檢測

根據(jù)GenBank 中公布的FIPV S 蛋白基因核苷酸序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計鑒別引物F/S。上游引物F/S-1：GGCATAATGGTTTTACCTGGTG；下游引物F/S-2：TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT。擴增產(chǎn)物大小為142 bp。

使用該引物，對4 例腹水樣品進行檢測，對陽性樣本參考Chang 等[7]和Licitra 等[9]使用的S1/S2、CV 特異性引物進行PCR 擴增，檢測S 蛋白的特殊氨基酸殘基是否存在突變。參照唐小娟[8]對3c 和7ab 蛋白分別設(shè)計的2 對引物3c-1F/3c-1R和3c-2F/3c-2R，7ab-1F/7ab-1R 和7ab-2F/7ab-2R。引物序列如表1 所示，所有引物，由上海生工合成（北京）。

表1 相關(guān)引物序列

根據(jù)SteadyPure 通用型RNA 提取試劑盒和SteadyPure 病毒DNA/RNA 提取試劑盒說明書，分別提取患貓腹水中RNA，以提取的RNA 為模板進行一步法RT-PCR 擴增；PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對產(chǎn)物進行回收測序。

1.6 F/S、S1/S2、CV、3c、7ab 蛋白基因遺傳序列分析

根據(jù)測序結(jié)果，應(yīng)用NCBI 檢索同源序列，利用MEGA-X 軟件中鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建遺傳進化樹，并用Bootstrap 方法重復(fù)1 000 次進行檢驗，其他參數(shù)使用默認值；再利用DNAstar、DNAMAN 等生物學(xué)軟件，對獲得的序列進行同源性比對。

1.7 病毒滴度（TCID50）測定

將從陽性病料中分離得到的毒株，用細胞維持液作10 倍系列稀釋，分別接種于96 板中的CRFK 細胞。每孔加入不同稀釋度病毒液0.1 mL，每個稀釋度重復(fù)8 孔，同時設(shè)置空白和陽性對照孔；將培養(yǎng)板置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中吸附1 h 后，添加維持培養(yǎng)液0.1 mL，置倒置顯微鏡下觀察；每天觀察2 次，連續(xù)觀察5 d，觀察到明顯的CPE 后，按照Reed-Muench 法計算TCID50。試驗重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒株分離

將處理過的患貓腹水和各組織接種于CRFK細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均產(chǎn)生細胞變圓、脫落、拉絲、融合等典型CPE（圖1）

2.2 RT-PCR 檢測

2.2.1 腹水檢測 對無菌采集的4 例腹水樣本提取RNA 后，應(yīng)用引物F/S 進行RT-PCR 檢測，編號分別為BJ-1、BJ-2、BJ-3、BJ-4，其中BJ-3 和BJ-4 鑒定結(jié)果顯示為陽性（圖2）。

2.2.2 分離毒株檢測 對檢測為陽性的BJ-3、BJ-4 腹水樣本及其各組織病料，在細胞上增殖后收集細胞和上清提取RNA，然后根據(jù)引物F/S 進行PCR 檢測，結(jié)果BJ-3 分離毒株顯示為陰性（圖3-A），BJ-4 為陽性（圖3-B）。將BJ-4 分離毒株命名為FCoV BEJ5-2021（以下簡稱為B5），并對其進行F/S（圖4-A）、S1/S2（圖4-B）、CV（圖4-C）、3c-1F/3c-1R（圖4-D）、3c-2F/3c-2R（圖4-E）、7ab-1F/7ab-1R（圖4-F）、7ab-2F/7ab-2R（圖4-G）等各基因型檢測，結(jié)果均為陽性。

2.3 F/S、S1/S2、CV、3c、7ab 遺傳序列分析

PCR 擴增后，對陽性腹水分離的毒株B5 測序，測序結(jié)果首先運用DNAMAN 對3c、7ab 蛋白基因進行全段拼接，再運用MEGA-X 軟件對測序所得的F/S、S1/S2、CV、3c、7ab 蛋白編碼基因核苷酸序列片段和GenBank 中已發(fā)表的國內(nèi)外參考毒株序列構(gòu)建遺傳進化樹，最后利用DNAstar 生物學(xué)軟件，對BJ-4 分離得到的毒株進行同源性比較。

2.3.1 F/S 序列 從分離毒株B5 擴增得到的通用型F/S 蛋白編碼基因，經(jīng)測序繪制基因遺傳進化樹并進行同源性比較。由基因遺傳進化樹（圖5）可知：構(gòu)建的基因遺傳進化樹中有兩個明顯的大分支，其中B5 分離株與荷蘭2012 年JQ304508.1參考毒株屬于同一分支，親緣關(guān)系較近，而與美國和英國UU54、C1Je 等分離毒株屬于不同的大分支，親緣關(guān)系較遠。由同源性比較結(jié)果可知：分離毒株B5 基因核苷酸序列與GenBank 中登錄號 為MT250357.1、MT250377.1、MT250353.1 的VGCaFn@14 意大利血清型I 型分離株同源性達到99.8%。

3.3.2 S1/S2 序列 從BJ-4 樣品中分離的毒株B5擴增得到的S1/S2 蛋白編碼基因序列，根據(jù)測序結(jié)果繪制基因遺傳進化樹并進行同源性比較。由基因遺傳進化樹（圖6）可知：基因進化樹中有兩個大分支，其中B5 分離株S1/S2 蛋白編碼基因序列與我國山東YD8 和上海SH1802 分離株同屬一個分支，親緣關(guān)系較近，與2004 年我國上海登錄號為MT112946.1 的分離株屬兩個大分支，親緣關(guān)系較遠。由同源性比較可知：分離毒株B5 基因核苷酸序列與GenBank 中登錄號分別為MT112935.1 和MT112946.1 的我國分離毒株YD8 和SH1802 的同源性分別達到94.3%和94.2%。

2.3.3 CV 序列 從BJ-4 樣品中分離的毒株B5擴增得到的CV 蛋白編碼基因序列，根據(jù)測序結(jié)果繪制基因遺傳進化樹并進行同源性比較。由基因遺傳進化樹（圖7）可知：B5 分離株與我國浙江分離株ZJU1617、德國分離株FECV5、荷蘭參考分離株FIPV4 和FIPV 屬于同一小分支，親緣關(guān)系較近，與美國UU54 分離株分屬兩個小分支，親緣關(guān)系較遠，而與德國FIPV3F 分離株、荷蘭FECV219 分離株分屬兩個大分支，親緣關(guān)系最遠。由同源性比較可知：分離毒株B5 基因核苷酸序列與GenBank 中登錄號為HQ738709.1 的荷蘭參考分離毒株FIPV369 同源性達到99.3%。

2.3.4 3c 序列 從BJ-4 樣品中分離的毒株B5 擴增得到的3c 蛋白全長編碼基因，根據(jù)測序結(jié)果繪制遺傳進化樹和進行同源性比較。由基因遺傳進化樹（圖8）可知：B5 分離株與2017 年我國黑龍江參考分離毒株親緣關(guān)系比較近，屬于同一分支，與丹麥UG-FH8 參考分離株、我國黑龍江HRB 參考分離株親緣關(guān)系較遠，分屬于兩個大分支。由同源性比較結(jié)果可知：分離毒株B5 的基因核苷酸序列與GenBank 中登錄號分別為KJ665855.1、KJ665843.1、KJ665836.1、KJ665835.1 的德國參考分離毒株FIPV16F、FIPV08A、FIPV03F、FIPV03A 同源性均為98.9%。

2.3.5 7ab 序列 從BJ-4 樣品中分離的毒株B5擴增得到的7ab 蛋白全長編碼基因，根據(jù)測序結(jié)果繪制遺傳進化樹和進行同源性比較。由基因遺傳進化樹（圖9）可知：B5 分離株在7ab 蛋白編碼基因上與我國上海參考分離株SH1807、浙江分離株ZJU1617 以及美國參考分離株FCoVWSU791146親緣關(guān)系較近，同屬一個分支，而與我國黑龍江參考分離毒株DQ、HRB 親緣關(guān)系較遠，分屬兩個大分支。由同源性比較結(jié)果可知：分離毒株B5 基因核苷酸序列與GenBank 中登錄號為MT112933.1 的我國上海參考分離毒株（SH1807）和美國參考分離毒株（FIPV-UCD 15b-1）的同源性分別為99.4%和99.1%。

2.4 TCID50 測定

從各組織病料陽性樣本中分離病毒后，將分離得到的各稀釋度毒株接種8 孔CRFK 細胞，按照Reed-Muench 法計算得到不同病料分離毒株的TCID50。結(jié)果（圖10）顯示：腸管中分離毒株的TCID50最高，為10-6.5/0.1 mL；脾臟次之，TCID50為10-3.37/0.1 mL；再次是腹水，分離毒株的TCID50為10-2.6/0.1 mL；氣管中分離毒株的滴度最低，約是腸管中分離毒株的1/106。肝、腎、腎上腺、腦、肺、眼、心肌、食管、胃和膀胱等其他組織中也均分離到病毒。

3 討論

寵物貓在飼養(yǎng)過程中較少依賴寵物主，使得越來越多的城市工作者選擇飼養(yǎng)寵物貓，其飼養(yǎng)量已出現(xiàn)趕超寵物犬的趨勢[2]。而FIP 是引起貓死亡的主要疾病之一[10]。北京市已有FIP 流行病學(xué)相關(guān)研究[11]，但關(guān)于FIPV 的研究尚不充分，致病機制尚不明確，且不同地域的FCoV 存在一定差異，目前又缺少對北京市FCoV 毒株的研究，所以進一步解析FIPV 致病的分子機制，掌握毒株的遺傳進化關(guān)系，對此病的防治具有重要意義。

FCoV 對外界環(huán)境抵抗力非常差，對常見的化學(xué)試劑和消毒藥均較敏感，故較難在體外對其進行分離和傳代培養(yǎng)[12]。目前FCoV 分離多采用貓腎細胞系（CRFK）[13]、貓全胎巨噬細胞系（Fcwf-4）[14]和犬直腸癌細胞系（A72）[15]。比較上述不同細胞系，有研究[13]認為，使用CRFK 細胞系分離FCoV 的成功率較高。

本研究對北京市動物醫(yī)院收集到的4 例疑似FIP 腹水樣本進行檢測，通過RT-PCR 方法診斷出BJ-3 和BJ-4 兩例陽性病例。其中，BJ-3 中未分離出目標毒株，而利用CRFK 在BJ-4 中成功分離出1 株FCoV B5，并觀察到典型的CPE。造成此現(xiàn)象的原因可能是，BJ-3 雖然檢測為陽性，但是病料中病毒滴度低，收取病毒時存在損耗，造成目的基因不能得到有效擴增。

對B5 分離毒株不同蛋白編碼基因片段（S、CV、3c、7ab）進行測序分析，發(fā)現(xiàn)該毒株不同基因分型與不同參考毒株的親緣關(guān)系和同源性不同，表明基因進化樹分析只能確定其遺傳進化關(guān)系。

在本試驗擴增出F/S 蛋白編碼基因的樣品中，有1 份腹水樣品擴增出3c 蛋白編碼基因，但未成功擴增出7ab 蛋白編碼基因，經(jīng)過多次重復(fù)PCR反應(yīng)，也未成功擴增出其他蛋白編碼基因片段。造成這種現(xiàn)象的原因首先可能在于引物結(jié)合位點的序列變異，使引物不能正常結(jié)合，致使檢測失敗。其次，也可能是病料中病毒滴度很低，提取組織RNA 時逐漸降解導(dǎo)致變?yōu)槠位牟《綬NA，使相關(guān)基因擴增困難。再次，也可能是組織標本中各個蛋白編碼基因RNA 的量并不均等，擴增過程中優(yōu)先擴增量多的，或者是存在相同RNA 量的幾種基因，但是在不同的擴增反應(yīng)中，擴增效率并不相同，導(dǎo)致相關(guān)基因擴增失敗[8]。最后一種原因，可能是基因?qū)?yīng)的擴增條件不是最優(yōu)，導(dǎo)致不能檢測到目的基因，但是由于PCR 的高檢測靈敏度，這種可能性較小。

BJ-4 陽性病例為6 個月齡的雄性英國短毛貓，對其剖檢可見各臟器表面大范圍彌散性漿膜和實質(zhì)性肉芽腫，且存在嚴重的腹腔和胸腔積液。依據(jù)本研究對B5 毒株TCID50的檢測結(jié)果來看，該病毒在患貓腸管中含量最高，脾臟次之。一些研究[16-17]認為，F(xiàn)ECV 和FIPV 是獨立傳播的病毒。然而，越來越多的證據(jù)支持突變假說，F(xiàn)IPV 是由單個感染貓的FECV 通過突變演變而來的[18-22]，感染FECV 而無癥狀的貓，在恢復(fù)期與病毒再次感染的過程中，體內(nèi)的FECV 發(fā)生突變，導(dǎo)致病毒毒力和組織嗜性增強從而形成FIPV，并能在單核細胞和巨噬細胞中持續(xù)復(fù)制[23]，被感染的細胞產(chǎn)生細胞因子、黏附分子和酶，導(dǎo)致典型的FIP 血管炎及血管周圍病變[24]，繼而形成化膿性肉芽腫并伴有漿膜炎、系統(tǒng)性炎癥等病變。這可能是患貓腸管內(nèi)病毒載量較高的原因。在Pedersen 等[25]的研究中發(fā)現(xiàn)，在已經(jīng)確診的FIP 病例中，存在眼部病變的比例占29%，多數(shù)為雙側(cè)眼睛病變。本研究從BJ-4病例中分離出的B5 毒株，驗證了這一發(fā)現(xiàn)，提示人們通常低估了FIP 給眼睛造成的實際受損程度。

4 結(jié)論

本研究成功從FIP 陽性病料中分離到1 株FCoV BEJ5-2021（B5）。基于該毒株的F/S、S1/S2、CV、3c、7ab 蛋白編碼基因進化分析可知，不同基因分型對應(yīng)不同血清型和生物型，表明基因進化樹同源性分析只能確定遺傳進化關(guān)系。該分離毒株對貓腸、脾組織等有較強嗜性，而對胃、膀胱等組織嗜性較弱，同時眼睛也是病毒存在的器官之一。