弓形蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究進(jìn)展

張險(xiǎn)朋，王自強(qiáng)，李永福，楊得勝

（1.東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東東莞 523086；2.福建省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福建福州 350003）

弓形蟲(chóng)病是由剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）引起的一種世界性分布的人獸共患原蟲(chóng)病，在脊椎動(dòng)物中廣泛傳播，對(duì)胎兒和免疫缺陷患者的感染尤其令人擔(dān)憂(yōu)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為弓形蟲(chóng)是單一種、單一血清型，但不同蟲(chóng)株有不同基因型[1]。根據(jù)蟲(chóng)株的侵襲力、繁殖速度、包囊形成與否及對(duì)宿主的致死率等，剛地弓形蟲(chóng)可分為強(qiáng)毒株和弱毒株，當(dāng)前公認(rèn)的代表毒株分別為強(qiáng)毒RH 株、弱毒Beverley 株[2-3]。弓形蟲(chóng)于1908 年在北非突尼斯的嚙齒類(lèi)梳趾鼠（Ctenodactylusgondii）體內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)[4]，幾乎可以感染所有溫血?jiǎng)游铩Ｎ覈?guó)于1955 年首先在福建省的貓、兔等動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了弓形蟲(chóng)[5]，1964 年首次報(bào)告病例，但直到1977 年才引起重視。

弓形蟲(chóng)生長(zhǎng)周期需要兩個(gè)宿主：中間宿主廣泛，多種冷血、溫血?jiǎng)游锒紩?huì)被感染，終末宿主則是貓科動(dòng)物[6-7]。弓形蟲(chóng)的生活史包括有性和無(wú)性?xún)蓚€(gè)生殖階段，有性生殖只在終末宿主貓科動(dòng)物的小腸上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。生活史包括滋養(yǎng)體、包囊、裂殖體、配子體和卵囊等五種形態(tài)，前兩種形態(tài)見(jiàn)于中間宿主和終宿主體內(nèi)，后三種形態(tài)見(jiàn)于終宿主體內(nèi)[8]。弓形蟲(chóng)包囊或卵囊隨食物被貓科動(dòng)物吃入后，便侵入小腸上皮細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始增殖，其中一部分蟲(chóng)體從腸道中逸出，經(jīng)腸系膜淋巴結(jié)向全身各器官擴(kuò)散，并發(fā)育為速殖子和包囊體，完成無(wú)性生殖過(guò)程；另一部分蟲(chóng)體在小腸內(nèi)繁殖成為大、小兩種配子體，而后分別產(chǎn)生雌、雄配子，雌雄配子結(jié)合為合子，合子再發(fā)育為卵囊[9]。在合適條件下卵囊成熟，當(dāng)中間宿主吃進(jìn)成熟卵囊后，引發(fā)弓形蟲(chóng)病。

弓形蟲(chóng)病是一種機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)病，多為隱性感染，無(wú)明顯臨床癥狀，很少發(fā)現(xiàn)健康宿主出現(xiàn)嚴(yán)重病癥。王玉燕等[10]2017 年5—6 月對(duì)徐州市5個(gè)未免疫弓形蟲(chóng)疫苗的豬場(chǎng)母豬血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)產(chǎn)母豬的弓形蟲(chóng)IgG 抗體陽(yáng)性率普遍偏高，最高可達(dá)63.6%，而做過(guò)滅鼠措施或用磺胺類(lèi)藥物預(yù)防的養(yǎng)殖場(chǎng)母豬弓形蟲(chóng)IgG 抗體陽(yáng)性率明顯低于未做過(guò)的養(yǎng)殖場(chǎng)（P＜0.05）。Qing 等[11]用間接血凝試驗(yàn)（IHA）檢測(cè)山東省驢群的弓形蟲(chóng)感染情況，結(jié)果顯示弓形蟲(chóng)抗體陽(yáng)性率為17%（213/1278）。雷雪珍[12]對(duì)2016—2018 年從廣東省多地收集的寵物犬貓和流浪犬貓血樣進(jìn)行弓形蟲(chóng)熒光PCR 和ELISA 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)寵物犬和寵物貓弓形蟲(chóng)病原學(xué)陽(yáng)性率分別為0.91%和2.28%，而流浪犬和流浪貓弓形蟲(chóng)病原學(xué)陽(yáng)性率分別為47.00%和40.00%，同時(shí)流浪犬貓的弓形蟲(chóng)IgG 抗體陽(yáng)性率顯著高于寵物犬貓。彭永喜[13]對(duì)2017—2018 年采集的沈陽(yáng)地區(qū)犬、貓血清弓形蟲(chóng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，寵物犬、貓血清弓形蟲(chóng)抗體陽(yáng)性率分別為27.7%、20.5%，流浪貓為43.1%。王仁通[14]對(duì)大連市旅順口不同豬場(chǎng)的豬血清進(jìn)行弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，樣本總體弓形蟲(chóng)感染陽(yáng)性率為 18.3%（87/476）。據(jù)調(diào)查[15]，人間弓形蟲(chóng)的隱性感染普遍存在，在機(jī)體免疫力下降或缺陷時(shí)，弓形蟲(chóng)可在機(jī)體內(nèi)大量增殖，而后表現(xiàn)出一定的癥狀。但是動(dòng)物弓形蟲(chóng)病很少表現(xiàn)出獨(dú)有的特征性癥狀，很難通過(guò)臨床癥狀確診，因此該病的確診還需要更為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。

1 病原學(xué)診斷

病原學(xué)診斷是最早建立的弓形蟲(chóng)診斷方法，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，在20 世紀(jì)的弓形蟲(chóng)病診斷中起到了重要作用。

1.1 組織學(xué)診斷

組織學(xué)診斷方法是對(duì)樣品染色后，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察，找到病原體即為確認(rèn)的一種方法，常用的染色方法包括吉姆薩染色、HE 染色、過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物（PAP）染色、PAS 染色等[16-17]。采用常用的染色方法，對(duì)組織包囊進(jìn)行染色，可將寄生蟲(chóng)與宿主細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，在鏡檢中發(fā)現(xiàn)速殖子或假包囊即可確診為弓形蟲(chóng)感染，但發(fā)現(xiàn)包囊尚不能診斷為弓形蟲(chóng)感染，還應(yīng)結(jié)合臨床資料進(jìn)行綜合分析[18]。組織學(xué)診斷方法存在很多不確定性因素，雖可確認(rèn)檢出的蟲(chóng)體，但未檢出時(shí)存在假陰性可能，這與未取到有蟲(chóng)體的部位或者弓形蟲(chóng)形態(tài)不夠典型有關(guān)，因此該方法存在主觀(guān)性以及檢出率低、耗時(shí)和易漏檢等缺點(diǎn)。隨著技術(shù)的發(fā)展，不同的染色方法也開(kāi)始逐步得到擴(kuò)展應(yīng)用。宋光明[19]采用表面修飾Protein A 的磁性納米顆粒與弓形蟲(chóng)的特異性抗體孵育制備成探針，經(jīng)與待檢樣品震蕩、洗滌、重懸后在暗場(chǎng)顯微鏡下觀(guān)察。由于探針與蟲(chóng)體表面特異性結(jié)合，暗場(chǎng)下衍射出可用顯微鏡觀(guān)察的金黃色亮光的蟲(chóng)體輪廓，使得該方法的的最低檢測(cè)限可達(dá)到104個(gè)/mL，與普通PCR 方法的檢測(cè)能力相同，同時(shí)該方法檢測(cè)過(guò)程只需30 min，還可直接對(duì)血液進(jìn)行檢測(cè)。磁性納米顆粒因?yàn)槠淞己玫纳锵嗳菪院偷投拘远粡V泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，但在獸醫(yī)診斷行業(yè)的應(yīng)用還有待發(fā)展。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種法

接種法是將待檢樣品制備成液體，注入動(dòng)物腹腔后取其腹腔液鏡檢速殖子的方法。這種方法以貓生物測(cè)定法作為金標(biāo)準(zhǔn)，一般在接種后5～15 d內(nèi)收集貓糞鏡檢卵囊。而小鼠感染后一般會(huì)引起死亡，很少產(chǎn)生包囊，只可以檢測(cè)其腹水中的速殖子。接種法陽(yáng)性檢出率高，但耗時(shí)、昂貴且需要大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，不可大量應(yīng)用于臨床，存在一定的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，有時(shí)還可能引起病原擴(kuò)散，甚至造成操作者自身感染。

隨著診斷技術(shù)的發(fā)展，病原學(xué)診斷方法由于耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法滿(mǎn)足快速、高效、批量的檢測(cè)需求，在實(shí)驗(yàn)室診斷方面的應(yīng)用逐步減少。

2 分子生物學(xué)診斷

2.1 常規(guī)PCR 方法

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種被廣泛用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，可視為生物體外的特殊DNA 復(fù)制[20]。PCR 在反應(yīng)體系中經(jīng)過(guò)多個(gè)周期溫度循環(huán)，一般為30～35 個(gè)循環(huán)，使特定的DNA 片段數(shù)量可增加109倍。隨著PCR 技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，它已被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、食品學(xué)、法醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)寄生蟲(chóng)學(xué)等各領(lǐng)域。

目前，多個(gè)目標(biāo)基因可用于弓形蟲(chóng)的PCR 檢測(cè)，其中應(yīng)用最為廣泛的是529 bp 重復(fù)序列、B1基因以及P30基因[21]。王海燕等[22]以弓形體B1基因作為目標(biāo)片段建立PCR 方法，其檢出限為10個(gè)弓形蟲(chóng)速殖子DNA，且與寄生于豬體內(nèi)的其他6 種常見(jiàn)微生物無(wú)交叉反應(yīng)。崔平等[23]以弓形蟲(chóng)P30基因?yàn)槟繕?biāo)片段建立PCR 方法，其擴(kuò)增結(jié)果為預(yù)期的484 bp 片段，檢出限為5 個(gè)弓形蟲(chóng)速殖子，且與其他2 種寄生蟲(chóng)無(wú)交叉反應(yīng)。張?jiān)品宓萚24]以弓形蟲(chóng)IST1基因作為目標(biāo)片段建立PCR方法，其擴(kuò)增結(jié)果為預(yù)期的302 bp 片段，檢測(cè)限為7.81 pg/μL DNA。任科研等[25]以弓形蟲(chóng)微線(xiàn)粒體MIC3基因作為目標(biāo)片段建立PCR 方法，其擴(kuò)增結(jié)果為預(yù)期的1 080 bp 片段，與微小隱孢子蟲(chóng)、賈第蟲(chóng)、旋毛蟲(chóng)和球蟲(chóng)等相關(guān)寄生蟲(chóng)基因組無(wú)交叉反應(yīng)，檢出限為10 個(gè)速殖子DNA。袁恒青等[26]對(duì)安徽省豬源弓形蟲(chóng)的529 bp 重復(fù)序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其與GenBank 中的EF648169.1 株的同源性高達(dá)99.5%，且遺傳距離最為接近，適合作為弓形蟲(chóng)病分子生物學(xué)診斷的目標(biāo)基因。周志東[27]利用弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白GRA14基因作為檢測(cè)的靶基因，建立了弓形蟲(chóng)的特異PCR 檢測(cè)方法，檢出限為2.35 個(gè)弓形蟲(chóng)速殖子，試驗(yàn)比對(duì)優(yōu)于以B1基因與529 bp 重復(fù)序列為目的片段的PCR 檢測(cè)方法；同時(shí)對(duì)26 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)不同類(lèi)型樣品的PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，血液、廢料、尿液、組織、精液、廢水中均可檢出弓形蟲(chóng)陽(yáng)性，而血液樣品更適用于豬場(chǎng)弓形蟲(chóng)病的臨床診斷和監(jiān)測(cè)。

巢式PCR 是利用2 套引物對(duì)目標(biāo)基因開(kāi)展2輪擴(kuò)增的方法，可在微量的DNA 模板中獲得高濃度和高純度的靶基因片段。但巢式PCR 技術(shù)缺點(diǎn)亦相對(duì)明顯，因需兩次擴(kuò)增，使操作過(guò)程較為繁瑣，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)有較高要求，較容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[28]。張瑩光等[29]利用529 bp 重復(fù)序列建立的巢式PCR檢測(cè)方法能特異性擴(kuò)增出弓形蟲(chóng)基因片段，檢測(cè)限為0.1 pg 的弓形蟲(chóng)基因組DNA，敏感性是普通PCR 的100 倍。

2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）

LAMP 是核酸擴(kuò)增技術(shù)中的一種，被廣泛應(yīng)用于各種領(lǐng)域，包括疫病診斷和生物學(xué)鑒定。該方法利用了BstDNA 聚合酶的置換活性，在等溫條件下，通過(guò)4 對(duì)引物識(shí)別目標(biāo)基因的6 個(gè)區(qū)域[30]，敏感性高、特異性好，可以檢測(cè)病毒、細(xì)菌和真菌等病原體，也被廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)病診斷。Sotiriadou 等[31]依據(jù)弓形蟲(chóng)的目標(biāo)基因建立了檢測(cè)水樣中弓形蟲(chóng)的LAMP 方法，檢出限為0.1 個(gè)弓形蟲(chóng)滋養(yǎng)體DNA。Zhang 等[32]根據(jù)弓形蟲(chóng)Rep529基因的保守區(qū)域建立弓形蟲(chóng)LAMP 方法，檢出限為0.1 pg/mL，對(duì)疑似組織樣本的陽(yáng)性檢出率為85.7%，比普通PCR（76.9%）高，證明LAMP 方法比PCR 方法更靈敏。隨后，有LAMP 應(yīng)用于小鼠各種組織器官和患者血液樣本的弓形蟲(chóng)感染檢測(cè)[33-34]。郭俊杰等[35]以弓形蟲(chóng)529 bp 重復(fù)序列為目的片段建立的LAMP 技術(shù)可以檢測(cè)到弓形蟲(chóng)微量DNA。宇芙蓉[36]根據(jù)弓形蟲(chóng)WH6 株表面抗原1 的基因序列分別建立了LAMP 和PCR 檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)LAMP 的敏感性為PCR 的100 倍；對(duì)已知背景的樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LAMP 符合率為100%，而PCR 只有74%，兩種檢測(cè)方法結(jié)果相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。Mirahmadi 等[37]用LAMP方法檢測(cè)了118 名精神分裂癥患者的血樣，發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)檢出率為47.4%，比之前用巢式PCR檢測(cè)的（檢出率34.7%）要高。Sun[38]針對(duì)弓形蟲(chóng)的529 bp 保守序列建立的LAMP 方法，檢測(cè)限達(dá)到單個(gè)速殖子或10 個(gè)重組質(zhì)粒，檢出率為7.0%，比常規(guī)PCR方法（2.5%）高。LAMP可以在沒(méi)有精密儀器時(shí)快速、簡(jiǎn)便開(kāi)展檢測(cè)，其擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)熒光定量、電泳檢測(cè)，沉淀可以通過(guò)離心后肉眼觀(guān)察，不需要特殊的設(shè)備輔助，但由于該方法的高靈敏特點(diǎn)，受污染影響較大，因此在試驗(yàn)過(guò)程中要嚴(yán)格做好質(zhì)量控制，防止假陽(yáng)性發(fā)生。

隨著各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，不同檢測(cè)技術(shù)間的聯(lián)用也成為可能。薛楊繼[39]將LAMP 方法與測(cè)流試紙條（LFD）聯(lián)用，建立了LAMP-LFD 方法，檢測(cè)弓形蟲(chóng)的529 bp 重復(fù)序列。通過(guò)LFD 試紙條讀取LAMP 反應(yīng)結(jié)果，可在1 h 內(nèi)最低檢出1 fg 弓形蟲(chóng)全基因組。該方法靈敏度是PCR方法的100倍，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了將分子檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)化成可視化的免疫檢測(cè)，直接通過(guò)試紙條讀取，簡(jiǎn)化了LAMP 產(chǎn)物的鑒定過(guò)程。

2.3 熒光PCR 方法

目前，熒光PCR 技術(shù)是最常見(jiàn)的核酸檢測(cè)方法，其在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程，被廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)。2000 年，Lin 等[40]根據(jù)弓形蟲(chóng)的B1基因首先建立了弓形蟲(chóng)熒光PCR 方法，檢出限為0.05 個(gè)弓形蟲(chóng)速殖子。該方法用于胎兒組織切片時(shí)的檢測(cè)陽(yáng)性率與巢式PCR 一致，均為33.3%。Santoro 等[41]應(yīng)用建立的熒光PCR 方法，對(duì)117頭野豬組織樣品進(jìn)行弓形蟲(chóng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)78 頭野豬弓形蟲(chóng)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為44%。Lass 等[42]根據(jù)弓形蟲(chóng)B1基因建立熒光PCR 方法，對(duì)食用蔬菜的弓形蟲(chóng)污染情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為3.6%，這是首次對(duì)新鮮蔬菜進(jìn)行弓形蟲(chóng)調(diào)查。雷雪珍[12]以弓形蟲(chóng)的529 bp 重復(fù)序列作為靶標(biāo)建立了弓形蟲(chóng)熒光PCR 方法，該方法穩(wěn)定性好，R2在0.999 以上，檢出限為10 拷貝/μL，靈敏度是普通PCR 的100 倍以上。袁淑萍[43]等根據(jù)弓形蟲(chóng)保守基因序列建立的豬弓形蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)方法，在 101～107拷貝/μL 模板范圍內(nèi)有很好的線(xiàn)性關(guān)系，檢出限可達(dá)101拷貝/μL。Khadijeh 等[44]用熒光PCR 方法和巢式PCR 方法對(duì)視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎患者的弓形蟲(chóng)B1基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示熒光PCR方法對(duì)B1基因的檢出率達(dá)90%，而巢式PCR 方法僅能檢出10%的病患，顯示熒光PCR 方法的敏感度高于巢式PCR 方法。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，外周血單核細(xì)胞比全血或血清更適合用于弓形蟲(chóng)檢測(cè)。熒光PCR 方法在試驗(yàn)過(guò)程不用開(kāi)蓋，引物和探針相結(jié)合使用，特異性、敏感性較高，且不容易被污染，是目前應(yīng)用最廣泛的核酸檢測(cè)技術(shù)。

2.4 數(shù)字PCR 方法

數(shù)字PCR 方法（digital PCR，dPCR）是在熒光PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一種核酸絕對(duì)定量檢測(cè)方法，于1999 年首次由Bert Vogelstein 和Kenneth W.Kinzler 提出。該方法利用指數(shù)型函數(shù)和線(xiàn)性函數(shù)之間的轉(zhuǎn)化，對(duì)模板進(jìn)行有限稀釋?zhuān)鶕?jù)熒光信號(hào)進(jìn)行精確定量，被稱(chēng)為第三代PCR 技術(shù)。Marino 等[45]用建立的數(shù)字PCR 方法檢測(cè)西西里島魚(yú)樣品中的弓形蟲(chóng)，在來(lái)自12 種魚(yú)類(lèi)的147 份樣本中，32 份被發(fā)現(xiàn)感染弓形蟲(chóng)DNA；在16 份魚(yú)肉、表皮樣本和11 份腸道、鰓樣本中檢測(cè)出弓形蟲(chóng)DNA，定量檢測(cè)的結(jié)果為5.7×104copies/mL。證實(shí)了魚(yú)類(lèi)雖然不是弓形蟲(chóng)的生物宿主，但是有可能受到弓形蟲(chóng)卵囊的污染。其原因可能是未經(jīng)處理的污水排放至江河，卵囊經(jīng)河流流入海洋，而魚(yú)類(lèi)充當(dāng)了機(jī)械載體。數(shù)字PCR 方法可以做到樣品DNA 絕對(duì)定量，在低濃度樣品的檢測(cè)中更有優(yōu)勢(shì)，并且擴(kuò)增反應(yīng)受酶抑制劑的影響更小。

分子生物學(xué)診斷方法雖然靈敏，但其檢測(cè)的主要對(duì)象是弓形蟲(chóng)核酸，檢測(cè)結(jié)果受多個(gè)因素影響。張燁華等[46]選取了市售的6 種DNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)含弓形蟲(chóng)速殖子的豬膈肌樣品分別進(jìn)行基因組DNA 提取，結(jié)果顯示不同方法提取的DNA用PCR 檢測(cè)的結(jié)果存在一定差異，以TIANamp Genomic DNA Kit 提取效果最好。研究也發(fā)現(xiàn)不同熒光PCR 的溫度升高和降低，對(duì)弱陽(yáng)性樣本的檢出率有很大影響，如伯樂(lè)CFX96（熒光定量PCR 儀）在反應(yīng)程序整體溫度調(diào)高2 ℃或調(diào)低1 ℃范圍內(nèi)，有利于弱陽(yáng)性樣本的檢出。因此，應(yīng)用分子生物學(xué)方法對(duì)弓形蟲(chóng)病原體進(jìn)行檢測(cè)，需要針對(duì)不同的檢測(cè)對(duì)象不斷優(yōu)化試驗(yàn)條件，以確定最佳檢測(cè)方案。

3 免疫學(xué)診斷

3.1 染色試驗(yàn)（DT）

染色試驗(yàn)方法于20 世紀(jì)40 年代被首次提出，根據(jù)特異性抗體與蟲(chóng)體輔助因子發(fā)生協(xié)同作用后蟲(chóng)體胞漿對(duì)堿性美藍(lán)的親和力差異所設(shè)計(jì)，具有良好的敏感性和特異性?；钭甜B(yǎng)體與樣本中的抗體相作用，可加速滋養(yǎng)體發(fā)生變性，裂解蟲(chóng)體表膜使蟲(chóng)體表膜不被美藍(lán)所染，鏡檢觀(guān)測(cè)待檢樣品，50%不被著色者判為陽(yáng)性[47]。但該檢測(cè)需要活的滋養(yǎng)體，在樣品保存、制備過(guò)程存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)，因此使用受到很大限制。

3.2 間接血細(xì)胞凝集試驗(yàn)（IHA）

該檢測(cè)方法以抗原抗體特異性結(jié)合和弓形蟲(chóng)可溶性抗原致敏于紅細(xì)胞表面，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象的特性而建立，具有便捷、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，適合弓形蟲(chóng)病的大規(guī)模篩選。全敏秀[48]用IHA 對(duì)湖南省 14 市（州）未進(jìn)行弓形蟲(chóng)疫苗免疫的雞群開(kāi)展弓形蟲(chóng)感染情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)湖南省弓形蟲(chóng)總抗體陽(yáng)性率為33.6%（457/1 360）。張克傳[49]對(duì)感染家兔用IHA 與其他檢測(cè)方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示IHA 的檢測(cè)特異性為93.3%，敏感性為47.6%，總符合率為86.6%。向忠菊等[50]在弓形蟲(chóng)血清學(xué)調(diào)查中應(yīng)用IHA方法來(lái)檢測(cè)豬弓形蟲(chóng)的感染情況，結(jié)果顯示IHA 方法的缺點(diǎn)是會(huì)與血清發(fā)生交叉反應(yīng)，重復(fù)性較差，致敏紅細(xì)胞不穩(wěn)定，易發(fā)生非特異凝集而使試劑難以標(biāo)準(zhǔn)化。

3.3 改良凝集試驗(yàn)（MAT）

MAT 作為國(guó)際上公認(rèn)的弓形蟲(chóng)檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有準(zhǔn)確率高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。該方法于1997 年由Desmonts 首次建立[51]。Dubey 等[52]利用1 000 頭弓形蟲(chóng)感染母豬的血清進(jìn)行多種抗體檢測(cè)方法對(duì)比試驗(yàn)，比對(duì)結(jié)果顯示MAT 在豬的弓形蟲(chóng)隱性感染和發(fā)病檢測(cè)中均可行。佐思[53]用改良的MAT 試劑盒對(duì)91 份人血清、290 份豬血清、63 份小鼠血清進(jìn)行檢測(cè)，并與ELISA 和進(jìn)口MAT試劑盒進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明改良的MAT 試劑盒具有良好的特異性和敏感性，檢出率高于ELISA 試劑盒，準(zhǔn)確率與進(jìn)口的MAT 試劑盒相同，重復(fù)性好。楊娜等[54]應(yīng)用MAT 與IHA 分別檢測(cè)了遼寧省不同地區(qū)不同動(dòng)物的3 789 份血清，結(jié)果顯示MAT 法判定標(biāo)準(zhǔn)，敏感性、特異性和準(zhǔn)確性都優(yōu)于IHA。王仁通[55]用IHA 和MAT 對(duì)豬血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)輔助進(jìn)行PCR 判定，發(fā)現(xiàn)MAT 檢測(cè)結(jié)果與PCR 一致，而IHA 存在漏檢和假陽(yáng)性情況。Fernandes 等[56]用IHA 和MAT 同時(shí)檢測(cè)了89 只家貓，發(fā)現(xiàn)IHA 的陽(yáng)性檢出率為18%，MAT 為26%；IHA 的相對(duì)特異性達(dá)到了100%，但相對(duì)敏感性?xún)H為70%。

3.4 間接熒光抗體試驗(yàn)（IFAT）

IFAT 方法已在國(guó)外得到廣泛應(yīng)用，是一種理想的弓形蟲(chóng)抗體血清學(xué)檢測(cè)方法，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出商業(yè)化試劑盒，但由于國(guó)內(nèi)市場(chǎng)需求較小，間接熒光抗體試劑商業(yè)化程度明顯不足。孫希萌等[57]2008—2012 年對(duì)吉林和河北地區(qū)醫(yī)院和精神病院人群進(jìn)行弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IFAT 方法檢出的弓形蟲(chóng)抗體陽(yáng)性率為3.97%，與ELISA 的總體符合率僅為51.2%，因而在缺少標(biāo)準(zhǔn)參照的情況下，國(guó)產(chǎn)技術(shù)的穩(wěn)定性還有待考量。盧致民等[58]研制的弓形蟲(chóng)IFA 試劑盒與德國(guó)Viro-Immun 的試劑盒Youden指數(shù)分別為0.91 和0.98，敏感性和特異性間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且自制試劑盒在4 ℃條件下保存期為6 個(gè)月。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于IFAT 的報(bào)道很少，但該方法在制片染色后即可通過(guò)顯微鏡觀(guān)察結(jié)果，同時(shí)操作較為方便而具有良好的開(kāi)發(fā)推廣前景。

3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

弓形蟲(chóng)的ELISA 檢測(cè)方法在所有弓形蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)中應(yīng)用最普遍。羅才慶等[59]分別采用 IHA 和ELISA 方法檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體并做對(duì)照試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)IHA 和ELISA 方法均可用于豬弓形蟲(chóng)病的血清學(xué)調(diào)查和診斷，而且兩種方法的差異并不顯著，符合率也較高。張靜[60]利用弓形蟲(chóng)單克隆抗體B6G 建立了弓形蟲(chóng)阻斷ELISA 檢測(cè)方法并對(duì)32 份豬血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率與MAT 法一致，陽(yáng)性符合率為87.5%，陰性符合率為100%，表明所建立的阻斷ELISA 方法能有效檢出臨床豬血清的弓形蟲(chóng)抗體。李祎等[61]建立的循環(huán)抗原雙抗體夾心ELISA 方法，最低能夠檢測(cè)到血清中1.5 ng/mL GRA1 抗原。該方法與nPCR 相比具有較高的一致性，較市售商品化試劑盒更為準(zhǔn)確可靠。Liyanage等[62]系統(tǒng)比較了現(xiàn)有的ELISA 分析方法，包括檢測(cè)試劑組分、檢測(cè)性能，涵蓋了4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的57 篇文獻(xiàn)。在所調(diào)查的研究中，間接ELISA（占比95%）和自制ELISA（占比67%）是研究過(guò)程中最常見(jiàn)的檢測(cè)方法，在市售的試劑盒中法國(guó)IDvet 公司的“ID Screen?”多物種間接ELISA 試劑盒較為常見(jiàn)，因該試劑盒采用P30（SAG1）抗原和抗多組分偶聯(lián)物作為二抗，使其適用于反芻動(dòng)物、豬、犬和貓等多物種的血清弓形蟲(chóng)特異性抗體檢測(cè)，也可用于牛奶或肉汁的檢測(cè)。

雖然國(guó)內(nèi)診斷試劑盒的質(zhì)量與進(jìn)口試劑盒有一定差距，但也可滿(mǎn)足豬場(chǎng)日常檢測(cè)工作需求。黃翠琴等[63]對(duì)80 份豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較了三種國(guó)產(chǎn)弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量差異，結(jié)果顯示國(guó)產(chǎn)的弓形蟲(chóng)IgG 抗體檢測(cè)試劑盒性能穩(wěn)定，通過(guò)一致性檢驗(yàn)三種試劑盒的Kappa 系數(shù)分別為0.57、0.75、0.64，檢測(cè)結(jié)果一致性表現(xiàn)為中高度，差異不顯著（P＞0.05），可用于豬場(chǎng)的日常檢測(cè)工作。

3.6 膠體金快速診斷技術(shù)

20 世紀(jì)80 年代末期，人們將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)與層析分析技術(shù)結(jié)合發(fā)展建立了膠體金免疫診斷技術(shù)，由于其便捷、無(wú)污染、結(jié)果直觀(guān)等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛應(yīng)用。盧愛(ài)桃等[64]采用ELISA 和膠體金免疫層析法（GICA）對(duì)呼和浩特市254 只犬貓進(jìn)行弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種方法無(wú)明顯差異。ELISA 方法雖更為靈敏，但實(shí)際操作時(shí)需要專(zhuān)業(yè)的儀器設(shè)備；GICA 方法則操作簡(jiǎn)單，不需要實(shí)驗(yàn)設(shè)備，易于推廣。張寧[65]以GRA6-GRA2 蛋白作為標(biāo)記抗原制備了弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)試紙條，對(duì)臨床289 份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，將結(jié)果再與間接血凝試劑盒進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)試紙條的陽(yáng)性檢出率為2.42%，而間接血凝試劑盒為2.07%，二者符合率為99.5%。張寧[66]用GRA6-GRA2 蛋白作為標(biāo)記抗原制備膠體金試紙用于檢測(cè)貓弓形蟲(chóng)抗體，發(fā)現(xiàn)膠體金試紙敏感性為1:256，用膠體金試紙與間接血凝試劑盒對(duì)289 份樣本血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)二者符合率為99.5%。卓國(guó)榮[67]對(duì)280 份犬血清進(jìn)行檢測(cè)，用間接血凝檢測(cè)和膠體金試紙檢出的陽(yáng)性數(shù)分別為23 份（陽(yáng)性率8.21%）、25 份（陽(yáng)性率8.93%），結(jié)果表明兩種方法差異不顯著。但膠體金試紙操作簡(jiǎn)便、快捷、靈活，適合于快速檢測(cè)。

4 展望

作為一種人獸共感染寄生蟲(chóng)，弓形蟲(chóng)不僅影響畜牧業(yè)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，還對(duì)公共衛(wèi)生和動(dòng)物源性食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。由于該病的臨床特征不是很明顯，所以弓形蟲(chóng)病診斷需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確診。目前，免疫學(xué)檢測(cè)方法以ELISA和IHA 方法為主，已有較為成熟的商品化試劑盒或診斷試劑，這些方法在大規(guī)模檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查中起到了很大的作用，為弓形蟲(chóng)病防控提供了更為廣泛的技術(shù)支持。分子生物學(xué)方法近年來(lái)得到了長(zhǎng)足發(fā)展，與傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)方法相比，其速度、通量、特異性、敏感性各方面都有提升，相較于免疫學(xué)診斷，避免了獲得性免疫帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果。雖然分子生物學(xué)診斷技術(shù)在部分領(lǐng)域仍有一定局限性，但高度的特異性、敏感性?xún)?yōu)點(diǎn)仍使其應(yīng)用前景廣泛，其對(duì)弓形蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查、檢驗(yàn)檢疫和臨床診斷十分重要，是未來(lái)弓形蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)室診斷的主要發(fā)展趨勢(shì)。