泰萬菌素對豬繁殖與呼吸綜合征的防控效果試驗

張 帥，劉 媛，王 邁，谷建輝，趙云環(huán)，劉 瑩，左玉柱

（1.河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北保定 071001；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定 071001；3.邢東新區(qū)社會發(fā)展局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北邢臺 054000；4.石家莊市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊，河北石家莊 050000）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染豬引起的一種高度接觸性傳染性疾病[1]，因部分感染豬出現(xiàn)耳尖、尾尖、乳頭、四肢末端或皮膚發(fā)紺，故又稱“豬藍耳病”。PRRS 最早于1987 年發(fā)現(xiàn)于美國，后迅速蔓延至德國、比利時等歐洲國家。1991 年荷蘭科學家首次分離出該病毒，并將其命名為Lelysted virus毒株，稱“歐洲株”[2]；隨后美國分離出VR2332 毒株，稱“美洲株”。1996 年，我國首次發(fā)現(xiàn)PRRSV。郭寶清等[3]用PAM 細胞分離到了CH-1a 毒株，楊漢春等[4]利用Marc-145 細胞分離到了BJ-4 毒株。研究[5]發(fā)現(xiàn)，在我國歐洲型和美洲型毒株并存，但以美洲型毒株為主。PRRSV 是一種有囊膜的單股正鏈RNA 病毒[6]。豬感染PRRSV 后的臨床癥狀主要表現(xiàn)為不同年齡段豬只出現(xiàn)發(fā)熱、出血、呼吸道癥狀，以及妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、弱胎為特征的繁殖障礙，嚴重影響著母豬健康及生產(chǎn)性能[7-8]。PRRSV 可通過干擾正常的抗原遞呈和T淋巴細胞活化來抑制機體免疫反應。IFN-γ 是重要的先天性細胞因子，可誘導細胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，誘導MHC 分子表達，促進抗病毒免疫，還可抑制微生物在呼吸道上皮附著，是防止病原體入侵機體的第一道防線，而PRRSV 感染會引起IFN-γ的表達水平上調(diào)[9-10]。IL-2 是一個關鍵的促炎細胞因子，是免疫應答和炎癥反應的基本要素，其表達有助于促進細胞免疫功能和有限的機體免疫應答，而PRRSV 感染會促進IL-2 等促炎細胞因子的釋放[11-12]。

現(xiàn)階段，我國的PRRS 防控以疫苗接種為主。但PRRS 疫苗對異源毒株交叉保護作用不強，導致我國養(yǎng)殖場的PRRS 陽性率仍然較高，疫苗免疫效果差和病毒的高變異率給豬場防控PRRS 帶來了嚴峻考驗[13]。近期研究[14]發(fā)現(xiàn)，泰萬菌素可起到抗PRRSV 的作用，適用于PRRS 治療。泰萬菌素系大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可增強非特異性免疫，抑制PRRSV 在巨噬細胞中的復制，縮短病毒血癥周期，減輕臨床癥狀，加快豬群體內(nèi)PRRSV 抗體的生成并減緩抗體下降，改善豬只體內(nèi)的IL-2 和IFN-γ 等細胞因子水平；同時還可通過降低母豬流產(chǎn)率，提高產(chǎn)健康仔豬數(shù)，以及改善母豬、仔豬病毒血癥等，達到控制病毒垂直傳播的目的[15]。為檢驗泰萬菌素對PRRS 的防控效果，本研究利用某公司生產(chǎn)的“金太萬”制品（泰萬菌素20%預混劑，下稱泰萬菌素A）和另一公司生產(chǎn)的同類產(chǎn)品（泰萬菌素20%預混劑，下稱泰萬菌素B）和黃芪多糖分別拌料飼喂妊娠母豬，通過統(tǒng)計產(chǎn)房生產(chǎn)情況、PRRSV 抗體水平、病原檢出率以及細胞因子IL-2、IFN-γ 表達水平等指標，綜合評價泰萬菌素的PRRS 防控效果，以期為PRRS 的有效防控提供新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 在繁母豬300 頭，品種為加系二元母豬，選自河北省某PRRS 陽性養(yǎng)殖場。

1.1.2 主要試劑耗材 PRRSV、豬乙腦病毒（JPEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬細小病毒（PPV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒，購自湖南國測生物技術(shù)有限公司；PRRSV ELISA 抗體檢測試劑盒，購自愛德士瑞士生物科技有限公司；RayBio Porcine IL-2 ELISA Kit 和RayBio Porcine IFN-gamma ELISA Kit，購自瑞博奧生物有限公司；病毒基因組DNA/RNA 快速提取試劑盒，購自艾德萊生物有限公司。

1.1.3 試驗器材 高速冷凍離心機，型號Neofuge 13R，上海力申科學儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺，型號SW-CJ-1FD，蘇州凈化設備有限公司產(chǎn)品；酶標儀，型號Multiskan FC，賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗豬場選擇 對河北省多地豬場進行PRRS 調(diào)查，統(tǒng)計豬場產(chǎn)房母豬流產(chǎn)率、產(chǎn)健仔數(shù)及比例，以及產(chǎn)弱胎、死胎或木乃伊胎數(shù)及比例；對疑似PRRS 癥狀豬場內(nèi)發(fā)燒豬只、流產(chǎn)母豬、流產(chǎn)胎兒以及仔豬睪丸去勢液，用實時熒光RT-PCR檢測試劑盒進行PRRSV、JPEV、CSFV、PPV、PRV 檢測，綜合評定豬場感染情況，以確定合適的試驗豬場。

1.2.2 試驗分組和用藥 在選定的某PRRS 陽性場，選擇300 頭母豬隨機將其分為3 組，即泰萬菌素A 組、泰萬菌素B 組和黃芪多糖對照組，每組100 頭，各組獨立飼喂，飼養(yǎng)條件相同。除所用藥物種類不同外，用藥量相同，均為每噸飼料中添加1 kg，10 d 為1 個用藥周期。

1.2.3 臨床指標統(tǒng)計 用藥結(jié)束后，以10 d 為1個階段，分為1～4 共4 個階段（40 d），統(tǒng)計每個階段的母豬流產(chǎn)率、產(chǎn)健仔率及產(chǎn)弱胎、死胎或木乃伊胎率。

1.2.4 臨床樣品采集 從每組100 頭妊娠母豬中隨機抽取25 頭，分別在試驗當天以及試驗后第15、40 天進行前腔靜脈采血取樣，做好耳號等相關記錄；對流產(chǎn)母豬，每窩隨機選擇1 頭胎兒進行解剖，取其肺臟等組織進行研磨；對3 組母豬所產(chǎn)仔豬在1.2.3 中的每個階段分別隨機抽取6 頭進行采血，并做好周齡和分組等相關記錄，然后3 000 r/min 離心5 min，分離血清或組織研磨液上清，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 流產(chǎn)原因診斷 利用病毒基因組DNA/RNA 快速提取試劑盒，對流產(chǎn)胎兒組織提取核酸，用PRRSV、JPEV、CSFV、PPV、PRV 實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒檢測，對流產(chǎn)胎兒組織進行實時熒光RT-PCR 檢測，診斷流產(chǎn)原因。

1.2.6 抗體水平檢測 利用PRRSV ELISA 抗體檢測試劑盒，對試驗當天及試驗后第15、40 天采集的母豬血液樣品和在4 個階段隨機抽取的仔豬血液樣品進行PRRSV 抗體測定，統(tǒng)計S/P值。

1.2.7 PRRS 病原檢測 對母豬PRRSV 抗體檢測結(jié)果統(tǒng)計后，對抗體水平偏高的豬只（S/P＞2.0），用PRRSV 實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒進行病原檢測，對比試驗當天及試驗后第15、40 天采集血液的病毒水平。

1.2.8 細胞因子水平檢測 利用RayBio Porcine IL-2 ELISA Kit 和RayBio Porcine IFN-gamma ELISA Kit，對試驗當天及試驗后第15、40 天采集的血液樣品進行IL-2 和IFN-γ 水平檢測，并統(tǒng)計每次采集血液的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗豬場選擇

經(jīng)調(diào)查，河北省某豬場妊娠母豬出現(xiàn)發(fā)燒、流產(chǎn)以及產(chǎn)弱胎、木乃伊胎等疑似PRRS 癥狀。對該豬場產(chǎn)房母豬流產(chǎn)率、產(chǎn)健仔數(shù)及比例以及產(chǎn)弱胎、死胎或木乃伊胎數(shù)及比例統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)房生產(chǎn)的50 頭母豬中有1 頭出現(xiàn)流產(chǎn)，流產(chǎn)率為2.00%，產(chǎn)健仔率為84.98%，產(chǎn)弱胎、死胎或木乃伊胎率為15.02%。

對母豬血液、流產(chǎn)胎兒組織和仔豬睪丸去勢液，用PRRSV、JPEV、CSFV、PPV、PRV 實 時熒光RT-PCR 檢測試劑盒進行PCR 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JPEV、CSFV、PPV、PRV 均為陰性，只有PRRSV 為陽性（圖1）。綜合考慮在繁母豬數(shù)量、飼養(yǎng)環(huán)境等因素后，最終選擇該豬場進行試驗。

2.2 臨床指標統(tǒng)計

對所有試驗母豬停藥后，以10 d 為1 個周期進行為期40 d 的妊娠母豬流產(chǎn)率、產(chǎn)健仔率以及產(chǎn)弱胎、死胎或木乃伊胎率統(tǒng)計。結(jié)果（表1）顯示：在第1 階段，3 組母豬的產(chǎn)健仔率與試驗前相當；隨著試驗的進行，泰萬菌素A、B 組母豬的產(chǎn)健仔率表現(xiàn)出不同程度地升高，產(chǎn)弱胎、死胎或木乃伊胎率相應降低，而黃芪多糖對照組在第2、4 階段分別出現(xiàn)1 頭母豬流產(chǎn)，耳號分別為170 和321，即表現(xiàn)出2.00%的流產(chǎn)率；在第4 階段，泰萬菌素A、B 組母豬的產(chǎn)健仔率分別達到94.44%、91.89%，產(chǎn)弱胎、死胎或木乃伊胎率分別降低到5.56%、8.11%，而黃芪多糖對照組的產(chǎn)健仔率仍為84.38%。以上結(jié)果表明，泰萬菌素可明顯降低母豬流產(chǎn)率，提高分娩母豬產(chǎn)健仔率，降低產(chǎn)弱胎、死胎或木乃伊胎率，且效果略優(yōu)于黃芪多糖（P＞0.05）。

表1 臨床指標統(tǒng)計

2.3 流產(chǎn)胎兒病原檢測

對黃芪多糖對照組耳號為170 和321 的母豬流產(chǎn)胎兒組織進行實時熒光RT-PCR 檢測，結(jié)果JPEV、CSFV、PPV、PRV 均為陰性，PRRSV 為陽性（圖2）。

2.4 PRRSV 抗體檢測

2.4.1 母豬 對試驗當天及試驗后第15、40 天采集的血液樣品進行PRRSV 抗體水平測定。統(tǒng)計結(jié)果（圖3）顯示：隨著采血時間的遞增，3 組豬群PRRSV 抗體S/P值均表現(xiàn)出下降趨勢，但泰萬菌素A、B 組豬群S/P值的下降速度明顯緩于黃芪多糖組（P＜0.05）。

2.4.2 仔豬 對每個階段隨機抽取的仔豬血液樣品進行PRRSV 抗體水平測定，統(tǒng)計各階段采集血液的抗體檢測結(jié)果。統(tǒng)計結(jié)果（圖4）顯示：隨著周齡的遞增，3 組仔豬PRRSV 抗體S/P值均表現(xiàn)出下降趨勢，但泰萬菌素A、B 組所產(chǎn)仔豬的S/P值下降速度明顯緩于黃芪多糖對照組（P＜0.05），而A、B 組之間的S/P值差異性不顯著（P＞0.05），表明泰萬菌素可以提高母豬生產(chǎn)仔豬的抗體穩(wěn)定性；對4 個階段不同周齡的3 組仔豬PRRSV 抗體S/P值進行標準差（σ）分析，發(fā)現(xiàn)泰萬菌素A、B 組所產(chǎn)仔豬相同日齡的標準差值均遠小于黃芪多糖對照組（表2），表明泰萬菌素在提高仔豬PRRSV 抗體的穩(wěn)定性和整齊度效果上優(yōu)于黃芪多糖。

表2 不同周齡仔豬PRRS 抗體S/P 值標準差（σ）統(tǒng)計

2.5 PRRS 病原檢測

對篩選出的抗體水平偏高豬只（S/P＞2.0）于試驗當天及試驗后第15、40 天采集母豬血液進行PRRS 病原檢測。結(jié)果顯示：隨著試驗的進行，在泰萬菌素用藥組豬群中，PRRSV 抗體水平偏高豬只體內(nèi)的病毒核酸拷貝數(shù)降低，主要表現(xiàn)在Ct值增加，同時泰萬菌素A、B 組豬群的PRRSV 檢出率分別降低了75.00%、66.67%，而黃芪多糖對照組豬只體內(nèi)病毒核酸拷貝數(shù)增加，Ct 值降低。結(jié)果表明，泰萬菌素可以抑制母豬體內(nèi)的PRRSV復制，對PRRS 的防控效果優(yōu)于黃芪多糖。

2.6 細胞因子檢測

對母豬試驗當天及試驗后第15、40 天采集的血液樣品進行IL-2、IFN-γ 水平測定。隨著采血時間的遞增，泰萬菌素給藥組的IL-2 質(zhì)量濃度在用藥開始后呈明顯下降趨勢，到試驗的第40 天趨于正常水平，而黃芪多糖對照組IL-2 的質(zhì)量濃度隨著試驗天數(shù)的遞增呈緩慢上升趨勢（圖5-A）；泰萬菌素給藥組與黃芪多糖對照組豬群試驗當天及試驗后第15、40 天的IL-2 質(zhì)量濃度均差異顯著（P＜0.05），而泰萬菌素給藥組豬群間的IL-2質(zhì)量濃度差異均不顯著（P＞0.05）。泰萬菌素給藥組IFN-γ 質(zhì)量濃度呈上升趨勢，而黃芪多糖對照組IFN-γ 質(zhì)量濃度變化趨于平緩（圖5-B）；泰萬菌素給藥組與黃芪多糖對照組豬群試驗當天及試驗后第15、40 天的IFN-γ 質(zhì)量濃度均差異顯著（P＜0.05），而泰萬菌素給藥組豬群間的IFN-γ質(zhì)量濃度差異均不顯著（P＞0.05）。

3 討論

PRRSV 至今仍是全球養(yǎng)豬生產(chǎn)中的重要病原體之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[16]。目前防控PRRS 的主要策略是接種疫苗，其中接種最廣泛的是滅活疫苗和弱毒疫苗。滅活疫苗安全性高，但是免疫效果差，而弱毒疫苗免疫效果好，但容易出現(xiàn)毒力返強現(xiàn)象[2]。就目前的PRRS 控制現(xiàn)狀來看，急需研究高效疫苗和特效藥，提高生豬養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益[17]。有研究[18]指出：泰萬菌素活性不同于其他抗生素，其脂溶性強，且能進入巨噬細胞次級小體內(nèi)。偏堿性的泰萬菌素可提高次級小體內(nèi)的pH，改變PRRSV 粒子復制需要的pH 環(huán)境，從而抑制PRRSV 復制，并在巨噬細胞胞內(nèi)溶酶體作用下將PRRSV 迅速消化[17]。同時，還可以通過改善豬只體內(nèi)的IL-2 和IFN-γ 等細胞因子水平，加速抗體形成，減緩抗體下降，降低母豬流產(chǎn)率，提高產(chǎn)健康仔豬數(shù)，以及改善母豬、仔豬病毒血癥等手段，控制病毒的垂直傳播[19]。因此，在當前日益關注獸藥殘留、動物源細菌耐藥性的社會背景下，泰萬菌素能很好滿足畜禽養(yǎng)殖場的用藥需求[20]。

本研究對妊娠母豬給藥泰萬菌素和黃芪多糖，然后觀察臨床生產(chǎn)指標、母豬和仔豬血清抗體水平、PRRS 病原檢出率和水平以及細胞因子IL-2 和IFN-γ 的表達水平，綜合評價泰萬菌素的PRRS 防控效果。通過臨床生產(chǎn)指標可以看出，豬群給藥泰萬菌素后在提高母豬產(chǎn)健仔率以及降低產(chǎn)弱胎、死胎或木乃伊胎率方面有著明顯改善，而黃芪多糖組則沒有明顯改變。通過特異性指標PRRSV 抗體水平檢測可以看出，泰萬菌素給藥組母豬血清中的PRRSV 抗體水平下降速率明顯低于黃芪多糖對照組，且泰萬菌素給藥組與黃芪多糖組在試驗當天和試驗后第15、40天采集血清的抗體S/P值差異顯著，而泰萬菌素給藥組間差異不顯著，表明泰萬菌素可以減緩PRRSV 抗體水平下降；對仔豬PRRSV 抗體水平的檢測結(jié)果顯示，泰萬菌素給藥組母豬所產(chǎn)仔豬的PRRSV 抗體下降速度均緩于黃芪多糖對照組，表明泰萬菌素可以穩(wěn)定仔豬的PRRSV 抗體水平[21]；根據(jù)標準差所體現(xiàn)的離散度可以看出，泰萬菌素可以提高仔豬PRRSV 抗體整齊度；對PRRSV 血清抗體檢測值偏高豬只的病原檢測結(jié)果顯示：泰萬菌素給藥組在抑制母豬體內(nèi)PRRSV 復制方面起重要作用，使PRRSV 檢出率大幅度降低；從母豬血清細胞因子檢測結(jié)果可以看出：泰萬菌素給藥組誘導的IL-2 水平低于黃芪多糖組，表明泰萬菌素可以抑制機體可能產(chǎn)生的炎癥反應，促進免疫應答。IFN-γ 表達水平的上升與下降也與機體的免疫調(diào)節(jié)相關，對試驗初采集的血液進行IFN-γ 檢測時發(fā)現(xiàn)，3 組母豬的IFN-γ 水平相當，而在用藥后，泰萬菌素給藥組的IFN-γ 表達量明顯高于黃芪多糖對照組，且試驗時間為秋末冬初，正值豬群抵抗力普遍下降之時，這更能體現(xiàn)出泰萬菌素可以誘導機體的IFN-γ 表達，促進機體產(chǎn)生更快更強的免疫反應，促進抗原遞呈[22]。綜合以上各種指標來看，泰萬菌素的PRRS 防控效果優(yōu)于黃芪多糖。

4 結(jié)論

試驗發(fā)現(xiàn)，兩個廠家的泰萬菌素均可降低母豬流產(chǎn)率以及產(chǎn)弱胎、死胎或木乃伊胎率，提高母豬產(chǎn)健仔率，減緩母豬PRRSV 抗體下降，穩(wěn)定仔豬PRRSV 抗體水平，提高仔豬PRRSV 抗體整齊度以及抑制PRRSV 復制，并在一定程度上調(diào)節(jié)母豬的免疫反應，對PRRS 有著明顯的防控效果，這為PRRS 防治提供了一種新思路。