雞毒支原體MG熒光定量PCR技術評估實驗室MG核酸污染方法

張承新 張鵬 彭曉艷 王海蘭 曲秀娟 姜皓 盧艷慧 李新 郭龍宗 李玉燕

摘 要：為了評估雞毒支原體（MG）非免疫雞群的MG感染，常采用MG熒光定量PCR技術進行監(jiān)測;而在雞群的MG凈化監(jiān)控前，需要對實驗室進行MG核酸污染評估，無污染后才能進行后續(xù)的凈化檢測工作。本實驗采用MG熒光定量PCR技術評估實驗室各區(qū)域的MG核酸污染情況，如果存在核酸污染，需要采取一系列的消毒措施，直至實驗室MG核酸污染監(jiān)控為陰性。

關鍵詞：雞毒支原體;熒光定量PCR;核酸污染

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2022）03-0060-03

熒光定量PCR（real-time PCR），是一種使用熒光定量PCR擴增裝置實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物并進行分析的方法。與常規(guī)PCR技術比較，熒光定量PCR可以對起始模板準確定量，能夠對擴增反應實時檢測;而常規(guī)PCR不能。根據(jù)熒光收集的機制，熒光定量PCR分為探針法和染料法;本研究采用探針法MG熒光定量試驗評估實驗室MG核酸污染。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器及試劑

ABI Q5熒光定量PCR儀（QuantStudioTM 5 Real-Time PCR Instrument）;RealPCR 敗血性支原體/DNA檢測混合液，購自IDEXX公司，批號：44B1045，有效期至2022年8月8日。

1.2 采樣方法

在1.5 mL離心管中加入適量PCR級水，將植絨拭子浸入離心管中，在離心管壁上擠壓，去除多余的水，之后用拭子對實驗室各功能間環(huán)境樣品進行采樣;在取樣區(qū)旋轉擦拭2～3次，再將拭子放回離心管中，旋渦震蕩混勻，洗脫拭子上的核酸;擠壓后拭子棄掉，離心管中液體作為熒光定量PCR待檢樣品。

1.3 采樣區(qū)域

根據(jù)實驗室的布局和實驗區(qū)域劃分，用不同的拭子對每個待檢測污染監(jiān)控區(qū)域進行取樣，并進行編號。實驗室采樣區(qū)域見表1。

1.4 實驗方法

參照試劑盒說明書進行操作，總反應體系為25 μL：目標檢測預混液10 μL，DNA擴增預混液10 μL，樣品DNA 5 μL。

擴增程序：50 ℃ 15 min，95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s ;共45個循環(huán)。

2 熒光定量PCR檢測結果

實驗有效標準：陽性對照FAM Ct值<38，HEX（VIC）<38;PCR陰性對照FAM Ct值無信號，HEX（VIC）≥36。

根據(jù)實驗室環(huán)境采樣區(qū)域熒光定量PCR檢測結果顯示：在MG疫苗株或者野毒樣品檢測后，樣品制備室和基因擴增室存在不同程度的MG陽性核酸污染，而試劑制備室為潔凈區(qū)，未檢測到MG陽性核酸污染。實驗室環(huán)境采樣區(qū)域熒光定量PCR檢測結果見表2。

3 防控措施

3.1 核酸污染去除措施

針對MG陽性核酸污染區(qū)域，使用84消毒液或其他含氯消毒液進行消毒處理，使用工作濃度有效氯含量高于2 000 mg/L，可以用試紙條進行濃度含量測定。

污染工作臺處理方法：用84消毒液作用5～10 min，再用75%酒精擦拭2～3遍;污染移液器及提取儀等儀器處理方法：用75%酒精擦拭2～3遍;污染功能間與超凈臺：同時用紫外燈照射30 min。之后再按照操作1的試驗方法繼續(xù)進行環(huán)境采樣評估，若仍存在核酸污染，按照3.1措施繼續(xù)進行消毒處理，直至核酸污染徹底清除。

3.2 核酸污染預防措施

3.2.1 制定科學完善的操作規(guī)程 為了預防核酸污染問題，首先根據(jù)實驗室功能，進行分區(qū)管理，針對每個實驗功能區(qū)制定詳細的操作流程及技術規(guī)范。根據(jù)日常核酸污染監(jiān)控結果，對容易忽略的方面，進行及時補充修訂，確保操作規(guī)程簡單、有效且具有較強操作性。

3.2.2 實驗室人流、物流嚴格控制 人員進入各功能區(qū)緩沖間后須更換衣服、拖鞋，每個實驗功能區(qū)的衣服顏色或款式要求不同，專人專鞋，防止交叉污染。進出各功能區(qū)需進行手部消毒，實驗前配套手套、口罩。工作服每周用84消毒液進行浸泡清洗。各實驗功能區(qū)的耗材禁止串用，各區(qū)域的垃圾桶、衛(wèi)生清潔工具、記號筆、移液器等采用顏色管理，不得混用。各功能區(qū)須配備相應的去污染消毒試劑，84消毒液、75%酒精噴壺等。工作人員在清潔時按照工作區(qū)流程進行，不得逆行。

3.2.3 規(guī)范實驗室廢棄物處理 試驗用移液器槍頭、試驗結束后的提取及PCR耗材先用84消毒液浸泡，再進行密封后丟棄?？谡帧⑹痔椎冉?4消毒液后丟棄，丟棄物及時進行清理。