三氯異氰尿酸粉低溫條件下對H9亞型禽流感病毒和細菌的消毒評估

吳蕾 唐磊 常海霞 劉杰 李巍 喬永 崔雪志 許傳田

摘 要：實驗旨在研究三氯異氰尿酸粉在低溫（4℃）條件下分別對流感病毒和大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的殺滅效果。以H9亞型禽流感病毒為供試病毒，測定其EID50。將有效氯含量為100、200、400mg/kg和800mg/kg的三氯異氰尿酸粉與定量的H9毒株混合，4℃條件下分別作用3、5、10、20min后接種SPF雞胚，棄掉24h死亡雞胚，37℃孵化器培養(yǎng)7d收取尿囊液，用1%雞紅細胞測定血凝價;將有效氯含量為100、200mg/kg和400mg/kg的三氯異氰尿酸粉分別與定量的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌懸液混合，4℃分別作用3、5、10、20min后，通過定量殺菌實驗測定其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果。結(jié)果表明，低溫條件下作用3、5、10、20min后，有效氯含量在200mg/kg以上，對H9病毒的殺滅率均達到100%;有效氯含量在100mg/kg以上，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅率達到100%。

關(guān)鍵詞：三氯異氰尿酸粉;H9亞型禽流感;低溫;大腸桿菌和金黃色葡萄球菌;殺滅率

中圖分類號：S859.79+9.1 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2022）03-0056-04

隨著養(yǎng)禽業(yè)集約化的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模越來越大，禽群一旦發(fā)生疫病損失巨大，切斷傳播途徑和消滅傳染源是疫病控制的有效手段，因此消毒預(yù)防是控制禽傳染病的重要措施之一[1-4]。

三氯異氰尿酸粉屬于有機含氯消毒劑，溶于水后可以生成具有殺菌作用的次氯酸[5]，對水中大部分細菌繁殖體、真菌、病毒芽孢都具有殺滅作用，屬于高效消毒劑。本研究通過定量殺菌實驗，同時以H9禽流感病毒為供試病毒，檢測三氯異氰尿酸粉低溫條件下對流感病毒和細菌的殺滅效果。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試試劑 三氯異氰尿酸粉由四川恒通動物制藥有限公司生產(chǎn)，批號：20210217。

1.1.2 供試菌株和毒株 大腸桿菌（ATCC25922）和金黃色葡萄球菌（ATCC6538）購買自中國工業(yè)菌種保藏管理中心;AIV-H9毒株于2019年1月分離自濱州肉種雞。

1.1.3 培養(yǎng)基 平板計數(shù)瓊脂購買自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號：1908208。

1.1.4 SPF雞胚 66枚9日齡SPF雞胚由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞場提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 Reed-Muench法 將H9毒株分別做10-5、10-6、10-7、10-8、10-9倍稀釋，接種SPF雞胚，每個稀釋度接種3枚，棄掉24 h內(nèi)死亡雞胚，培養(yǎng)7 d后收集尿囊液，測定血凝價。根據(jù)Reed-Muench法計算EID50。

1.2.2 三氯異氰尿酸粉的抗病毒實驗 將三氯異氰尿酸粉用滅菌的（121 ℃滅菌20 min）蒸餾水按比例配制成100、200、400 mg/kg和800 mg/kg有效氯溶液，吸取 0.1 mL H9病毒液加入到0.9 mL配制好的氯制劑溶液內(nèi)搖勻，在4 ℃條件下分別作用3、5、10 min和20 min;立即吸取反應(yīng)后的混合液0.1 mL加入到0.9 mL 1%硫代硫酸鈉溶液（已鑒定合格）中混勻，中和10 min終止反應(yīng)，接種9日齡SPF雞胚尿囊腔0.2mL/枚中和后的混合液，每個稀釋度接3枚。棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，37 ℃孵化器培養(yǎng)7 d，收取尿囊液，檢測血凝價。

同時以1%硫代硫酸鈉溶液代替消毒劑溶液同步進行上述各步驟，作為對照組，檢測血凝價。

1.2.3 菌懸液的制備 分別吸取大腸桿菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）甘油保藏的菌種100μL接種于100 mL肉湯液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng) 24 h。采用10倍稀釋和平板計數(shù)法，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液進行計數(shù)，用含1%蛋白胨的0.03 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS溶液）將菌液稀釋成含約 106～107 cfu/mL的菌懸液。

1.2.4 三氯異氰尿酸粉的殺菌效果實驗 將三氯異氰尿酸粉用滅菌蒸餾水按比例配制成100、200、400 mg/kg有效氯溶液，吸取0.5 mL大腸桿菌/金黃色葡萄球菌懸液加入到4.5 mL配制好的消毒液中混勻，4 ℃條件下分別作用3、5、10 min和20 min;立即吸取上述菌液與消毒劑的混合液0.5 L，加入到4.5 mL 1%硫代硫酸鈉溶液中混勻，中和10 min終止反應(yīng)，再吸取1 mL，使用平板計數(shù)，瓊脂采用傾注法，凝固后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h后作菌落計數(shù)（整個操作過程在超凈工作臺中進行）。

同時以洗脫液（含中和劑、1%蛋白胨和0.1%吐溫80的PBS溶液）代替消毒劑溶液同步進行上述各操作，作為對照組，計算殺菌率。

2 結(jié)果

2.1 H9毒株的EID50結(jié)果

按Reed-Muench法計算H9毒株的EID50為10-8/0.2 mL。詳細見表1。

2.2 三氯異氰尿酸粉對H9病毒的殺滅效果

檢測結(jié)果如表2。在4 ℃實驗室條件下，三氯異氰尿酸粉殺滅H9病毒能力較強，有效氯含量在200～800 mg/kg范圍內(nèi)，分別作用3、5、10、20min，其殺毒率均可達到100%。

2.3 三氯異氰尿酸粉的殺菌效果

大腸桿菌菌含量是3.05×106 cfu/mL;金黃色葡萄球菌菌含量是6.45×106 cfu/mL。

檢測結(jié)果如表3。結(jié)果表明，在4 ℃條件下，三氯異氰尿酸粉的殺菌能力極強，在100～400 mg/kg的濃度范圍內(nèi)，分別作用3、5、10、20 min，其殺菌率全部達到100%。

3 討論

2020年新型冠狀病毒（COVID-19）在國內(nèi)外爆發(fā)時，含氯消毒劑作為一種價格低廉、毒性較低的高效消毒劑被廣泛應(yīng)用[6]。三氯異氰尿酸粉屬于氯制劑，溶于水后生成次氯酸，次氯酸鹵化或者氧化細胞蛋白質(zhì)和脂質(zhì)而破壞病原體[7]，可以用于車輛、環(huán)境及飲用水的消毒。

部分消毒劑易受到低溫環(huán)境的影響，導(dǎo)致消毒效果不理想，三氯異氰尿酸粉在實驗室4 ℃條件下，有效氯量達到100 mg/kg作用 ，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率均可達到100%;當(dāng)有效氯含量達到200 mg/kg作用3 min，對H9病毒的殺滅率達100%。由此推出，在4 ℃實驗室條件下，有效氯含量在200 mg/kg以上時三氯異氰尿酸粉能取得較好的消毒效果。

該實驗結(jié)果是在實驗室條件下得出的數(shù)據(jù)，禽殖場在使用三氯異氰尿酸粉消毒時會受到消毒對象、有機物、生物膜、污染物、pH等因素的影響，因此畜禽養(yǎng)殖場使用此類消毒劑時需根據(jù)消毒對象適當(dāng)調(diào)整消毒濃度，以期達到較好的消毒效果。

參考文獻：

[1] 陳呂華，沈明亮，云麟.重視畜禽圈舍及環(huán)境消毒是畜牧業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46（1）：86-87.

[2] 袁正東.大型養(yǎng)禽場生物安全體系的建立與保障[J].中國家禽，2012，18 （4）：1-4.

[3] 孫秀如，盧永勝，張梅芳，等.如何建立種雞場的生物安全體系[J].中國家禽，2008，11（2）：43-44.

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[5] 徐兆瑜.新一代高效殺菌消毒劑——氯代異氰尿酸[J].化工之友，2001，6：18.

[6] 趙凱麗.酸性氧化電位水的殺菌機理及其氧化還原性研究[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2017：11-15.

[7] Crew J， Varilla R， Rocas TA， et al. NeutroPhase（?） in chronic non-healing wounds[J]. Int J Burns Trauma， 2012， 2（3）： 126-134.