促生菌對(duì)Cd脅迫下蔞蒿根系形態(tài)與生理代謝的影響

周小梅，董 萌，余紅兵，譚淑端，楊 楠

(1. 湖南城市學(xué)院 建筑與城市規(guī)劃學(xué)院，湖南 益陽(yáng) 413000；2. 數(shù)字化城鄉(xiāng)空間規(guī)劃關(guān)鍵技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 益陽(yáng) 413000；3. 湖南省城鄉(xiāng)生態(tài)規(guī)劃與修復(fù)工程技術(shù)研究中心，湖南 益陽(yáng) 413000；4. 湖南省村鎮(zhèn)飲用水水質(zhì)安全保障工程技術(shù)研究中心，湖南 益陽(yáng) 413000)

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，重金屬不可避免地進(jìn)入環(huán)境，近年來(lái)Cd 污染在土壤中普遍存在.2014年，我國(guó)環(huán)境保護(hù)部和國(guó)土資源部聯(lián)合發(fā)布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》指出：土壤無(wú)機(jī)污染物排首位的是Cd，其點(diǎn)位超標(biāo)率為7.0%[1].由于Cd 在土壤中無(wú)法降解，其較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性和高毒性極易通過(guò)食物鏈的“生物放大”作用影響人類(lèi)健康，被列為最危險(xiǎn)的重金屬之一[2-4].

Cd 并非植物生長(zhǎng)過(guò)程中的必需元素.當(dāng)土壤中的Cd 含量超過(guò)界限值8 mg·kg-1時(shí)，大多數(shù)植物會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)速度減慢、根系活力下降等Cd中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物死亡[5].根系是植物對(duì)土壤水分和養(yǎng)分吸收與利用的直接部位，也是激素等物質(zhì)合成的重要場(chǎng)所，其形態(tài)特征與植株地上部分的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)[6].由于根系與土壤顆粒直接接觸，受Cd 脅迫時(shí)根系便成為積累有毒物質(zhì)和受害最嚴(yán)重的部位[7].Cd 脅迫會(huì)改變植物根系形態(tài)，抑制根系生長(zhǎng)，損傷根尖的細(xì)胞核仁，減少根尖對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收，阻礙根系向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)，并對(duì)滲透調(diào)節(jié)等產(chǎn)生負(fù)面影響[7-8].促生菌可以促進(jìn)植物根系和地上部分的生長(zhǎng)，提高植物的抗逆性，緩解Cd 脅迫的壓力.因此，接種促生菌已經(jīng)成為一種經(jīng)濟(jì)有效、環(huán)境友好的Cd 污染治理策略[9-10].有研究表明，接種促生菌對(duì)植物根系有良好的促進(jìn)作用，可以增加植物根系干重和根長(zhǎng)等[10-11].促生菌的接種方式包括單接和混合接，一般認(rèn)為，單接優(yōu)于不接，混合接優(yōu)于單接[12-14].

蔞蒿(Artemisia selengensis)，菊科蒿屬，多年生草本，對(duì)Cd 具較強(qiáng)耐性，適合刈割，是洞庭湖濕地土壤實(shí)施Cd 污染修復(fù)的理想材料[15].課題組前期對(duì)蔞蒿的Cd 抗性生理及修復(fù)特性等已作了大量研究[16-17]，但在Cd 脅迫下促生菌如何調(diào)控蔞蒿的根系生長(zhǎng)發(fā)育及其機(jī)理尚未研究.

基于此，本研究以具促生功能的Bacillussp.T3，Pantoea agglomeransJ2 和Pseudomonas fluorescensY5 的混合菌劑為研究對(duì)象，通過(guò)盆栽試驗(yàn)，探究促生菌對(duì)Cd 脅迫下蔞蒿根系形態(tài)和生理指標(biāo)的影響，揭示促生菌對(duì)蔞蒿根系生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，以期為合理利用微生物菌劑提高蔞蒿的修復(fù)效果奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以蔞蒿的扦插苗為試材；基質(zhì)由草炭、蛭石和珍珠巖混合而成，購(gòu)自湖南紅星大市場(chǎng)；Bacillussp.T3 分離于蔞蒿根際土壤，能合成鐵載體和產(chǎn)酸；Pantoea agglomeransJ2 和Pseudomonas fluorescensY5 分離于蔞蒿莖葉，能分泌吲哚乙酸(IAA)，其菌株對(duì)Cd 均具一定耐受性.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

促生菌以Bacillussp.T3，Pantoea agglomeransJ2和Pseudomonas fluorescensY5的菌懸液混合而成.供試菌株分別接種于LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基中，在30 ℃和150 rpm 條件下，震蕩培養(yǎng)72 h；菌液于4 ℃下，以8 000 rpm 離心5 min，經(jīng)無(wú)菌生理鹽水潤(rùn)洗2 次；為確保各菌株試驗(yàn)用量一致，用無(wú)菌生理鹽水將各菌液濃度調(diào)節(jié)至1×108cfu·mL-1，各菌液等量混合制成接種菌劑.

基質(zhì)室內(nèi)自然風(fēng)干，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，加CdCl2溶液拌勻、平衡，分別使Cd2+濃度為0 和30 mg·kg-1；基質(zhì)平衡4 周后裝缽(缽大?。荷峡趶?0.5 cm、底徑7.5 cm、高9.5 cm)，每缽均裝基質(zhì)500 g.對(duì)基質(zhì)進(jìn)行加菌處理，處理共分3組：1)CK，含Cd2+濃度為0 mg·kg-1的無(wú)菌生理鹽水；2)Cd，含Cd2+濃度為30 mg·kg-1的無(wú)菌生理鹽水；3)Cd+促生菌，含Cd2+濃度為30 mg·kg-1和150 mL 混合菌懸液.將長(zhǎng)勢(shì)基本一致的蔞蒿扦插苗(帶3 片完全展開(kāi)葉)移栽于營(yíng)養(yǎng)缽，每次處理移栽15 缽，每缽1 株，澆透水；置于苗圃大棚正常養(yǎng)護(hù)，溫度為28±2 ℃，相對(duì)濕度65±5%，2 周后取蔞蒿根系進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定.

1.3 指標(biāo)測(cè)定

根系形態(tài)及鮮重的測(cè)定：采用 EPSON Expression 根系掃描儀進(jìn)行根系形態(tài)的掃描分析，用天平稱(chēng)取根系鮮重.

營(yíng)養(yǎng)元素含量的測(cè)定：參照梁泰帥等[18]的方法進(jìn)行消解，用流動(dòng)注射分析儀測(cè)定N 和P 含量，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定K 和Fe 含量.

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測(cè)定：分別采用苯酚法、考馬斯亮藍(lán)G-250 法、磺基水楊酸法進(jìn)行可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的檢測(cè)[19]；用比色法測(cè)定甜菜堿的含量[20].

內(nèi)源激素含量的測(cè)定：采用植物激素酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定根系中吲哚乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)的含量[21].

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并作圖，運(yùn)用SPSS 26.0 進(jìn)行單因素方差分析，并以L(fǎng)SD 進(jìn)行差異性比較.所有的數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)的平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2 結(jié)果與討論

2.1 促生菌對(duì)蔞蒿根系形態(tài)的影響

根系形態(tài)是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果，是根系生長(zhǎng)發(fā)育的整體表現(xiàn)[10].根系對(duì)逆境脅迫的感知先于地上部分.在逆境脅迫下，植物通過(guò)調(diào)整根系的形態(tài)和分布來(lái)適應(yīng)環(huán)境變化.根系形態(tài)包括：根長(zhǎng)、根徑、根表面積、根體積等，這些指標(biāo)在一定程度上可反映根系的生長(zhǎng)發(fā)育情況[22].田曉鋒等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Cd 脅迫顯著降低了梧桐幼苗根長(zhǎng)、根體積、根表面積等指標(biāo)；朱瑞婷[24]研究指出，Cd 脅迫下敏感性草坪草品種“橄欖球2 號(hào)”根長(zhǎng)明顯受到抑制，而根平均直徑(根徑)變化不顯著.本研究中，蔞蒿根長(zhǎng)、根表面積在Cd 脅迫下受到明顯抑制(見(jiàn)表1).與對(duì)照組(CK)相比，Cd 組的根長(zhǎng)和根表面積分別減少了36.8%和19.5%，根徑和根體積則分別增加了16.7%和54.8%.這說(shuō)明蔞蒿主要通過(guò)減少根長(zhǎng)、根表面積和增加根徑、根體積來(lái)適應(yīng)Cd 脅迫.雖然根長(zhǎng)與根表面積的減少可能會(huì)減弱蔞蒿根系對(duì)土壤中水分和養(yǎng)分的吸收，但根徑和根體積的增加會(huì)有一定程度的彌補(bǔ).在Cd 脅迫下，接種了促生菌的蔞蒿的根長(zhǎng)和根表面積分別顯著增加了26.9%和85.8%(見(jiàn)表1).可見(jiàn)，促生菌能夠通過(guò)增加根長(zhǎng)和根表面積來(lái)緩解Cd 脅迫造成的壓力，改善Cd 脅迫下蔞蒿根系的構(gòu)型，增強(qiáng)根系對(duì)土壤中水分和養(yǎng)分的吸收，減小Cd 脅迫帶來(lái)的傷害.

表1 不同處理組的蔞蒿根系形態(tài)變化

生物量是根系對(duì)Cd 脅迫的綜合反應(yīng)[25].在Cd 脅迫下，植物根部生物量顯著下降，干物質(zhì)積累量減少，通常抑制程度與Cd 脅迫濃度呈正相關(guān)[26-27].有研究表明，植物激素可通過(guò)刺激根表面積和根長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)植物根系的生長(zhǎng)與形態(tài)[28].吲哚丙酮酸脫羧酶是合成IAA 的關(guān)鍵酶，相比于對(duì)照樣本，吲哚丙酮酸脫羧酶突變體影響了植物根系形態(tài)，且IAA 缺陷突變體還能減少根系的數(shù)量[29-30].激素ABA 有利于根毛發(fā)育，促進(jìn)細(xì)胞增大，使植物從土壤中能獲得更多水分和養(yǎng)分，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)和發(fā)育[31].在本研究中，蔞蒿根系鮮重在Cd 脅迫下顯著降低(見(jiàn)表1).與對(duì)照組(CK)相比，Cd 組降低了28.6%；促生菌明顯增加了Cd 脅迫下蔞蒿根系鮮重，增幅為18.2%.其原因可能是由于菌株P(guān)antoea agglomeransJ2 和Pseudomonas fluorescensY5 能分泌IAA，可調(diào)節(jié)根系的構(gòu)型，更利于獲得養(yǎng)分，促進(jìn)Cd 脅迫下蔞蒿根系的生長(zhǎng)發(fā)育.

2.2 促生菌對(duì)蔞蒿根部各營(yíng)養(yǎng)元素含量的影響

根系的主要功能是從土壤中獲取水分和養(yǎng)分，所以良好的根系形態(tài)有利于改善根系對(duì)土壤中各營(yíng)養(yǎng)元素的吸收和利用.Cd 脅迫影響蔞蒿的根系形態(tài)，使其生物量減少，從而直接影響根系的生理功能.劉俊祥等[32]研究指出，Cd 脅迫下多年生黑麥草(Lolium perenneL.)根部的N、K 含量降低，P 含量升高；萬(wàn)雪琴等[33]研究顯示，楊樹(shù)根部K 含量隨Cd 脅迫濃度的增大而增加，P含量的變化則與Cd 脅迫濃度呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)e 含量在低濃度Cd 下增加，在高濃度Cd 下降低.

在本研究中，Cd 脅迫下的蔞蒿根部P 和Fe的含量與對(duì)照組相比，分別下降了 39.3%和24.4%，而N 和K 含量無(wú)顯著變化(見(jiàn)表2).

表2 不同處理組的蔞蒿根部各營(yíng)養(yǎng)元素含量變化

Cd 脅迫對(duì)植物根部N，P，K 和Fe 含量的影響因植物而異.因?yàn)椴煌参飳?duì)Cd 耐受性不同，Cd 脅迫對(duì)不同植物根系形態(tài)及其生理功能的影響存在差異.促生菌對(duì)蔞蒿根部的N 和K 含量影響不太大，但其P 和Fe 的含量則分別增加了86.8%和46.7%(見(jiàn)表2).這說(shuō)明促生菌可緩解Cd脅迫對(duì)蔞蒿根系的壓力，改善其抗?jié)B透脅迫的能力，提高根部對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的吸收.促生菌之所以能改善蔞蒿根部對(duì)各營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，這是因?yàn)椋築acillussp.T3 菌株能產(chǎn)生鐵載體促進(jìn)蔞蒿對(duì)Fe 的吸收，同時(shí)還能分泌有機(jī)酸改善根際各營(yíng)養(yǎng)元素的生物有效性；Pantoea agglomeransJ2和Pseudomonas fluorescensY5 菌株能分泌IAA，調(diào)節(jié)根系形態(tài)，促進(jìn)根系對(duì)各養(yǎng)分的吸收.

2.3 促生菌對(duì)蔞蒿根部滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

滲透調(diào)節(jié)是植物對(duì)逆境脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng).可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸和甜菜堿是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累有利于提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，增強(qiáng)植物的抗逆性[34].已有研究表明，長(zhǎng)時(shí)間的Cd 脅迫可使苧麻體內(nèi)積累大量的可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)[35]；馬藺根系中脯氨酸含量隨Cd 脅迫濃度的增加而增加，可溶性蛋白含量隨Cd 脅迫濃度增加呈先升后降的趨勢(shì)[36].

在本研究中，Cd 脅迫蔞蒿根部可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量較對(duì)照組(CK)分別下降了33.1%和18.2%，而脯氨酸和甜菜堿含量分別增加了228.9%和59.7%(見(jiàn)表3).

表3 不同處理組的蔞蒿根部滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化

以上研究表明，Cd 脅迫下，蔞蒿根系主要通過(guò)脯氨酸和甜菜堿的積累來(lái)維持根系細(xì)胞內(nèi)的滲透平衡，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，以此來(lái)抵御Cd脅迫的傷害.同時(shí)還說(shuō)明，不同植物對(duì)Cd 脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)有差異，且Cd 脅迫對(duì)植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響不僅與研究材料有關(guān)，還與Cd 脅迫的濃度及時(shí)間等因素密切相關(guān).Cd 脅迫下蔞蒿根部可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量的下降可能是因?yàn)椋喝~片葉綠素含量及光合效率的下降(數(shù)據(jù)未列出)，導(dǎo)致可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的合成減少[37].可溶性蛋白質(zhì)含量的下降也可能是因?yàn)镃d 脅迫下蔞蒿根系細(xì)胞產(chǎn)生較多的活性氧，而活性氧攻擊蛋白質(zhì)的氨基酸殘基，使蛋白質(zhì)合成受阻[36].

促生菌使得蔞蒿根部可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量分別提高了55.7%和46.1%，而脯氨酸和甜菜堿含量分別降低了29.6%和27.7%(見(jiàn)表3).由此可知，促生菌緩解了蔞蒿根系中Cd 脅迫對(duì)可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量的抑制，并減緩脯氨酸和甜菜堿含量的增加，以此來(lái)適應(yīng)Cd 脅迫的傷害.雖然已有部分研究表明，接種促生菌植株體內(nèi)的脯氨酸和可溶性糖含量均高于未接菌植株[38]，但也有研究表明，接種促生菌可顯著降低脯氨酸的含量[39]，其原因可能是因?yàn)榇偕梢愿淖兏彼嵘锖铣傻南嚓P(guān)基因表達(dá)[40].

2.4 促生菌對(duì)蔞蒿根部?jī)?nèi)源激素的影響

植物激素參與逆境脅迫，調(diào)節(jié)植物對(duì)逆境脅迫的抵抗能力，并影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[41-42].植物內(nèi)源激素有IAA、ABA 等.在根系的發(fā)育過(guò)程中，IAA 主要調(diào)控主根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和側(cè)根的發(fā)育[43]，ABA 則負(fù)責(zé)根毛生長(zhǎng)、刺激細(xì)胞體積、滲透調(diào)節(jié)等[31].在Cd 脅迫下，IAA 誘導(dǎo)基因表達(dá)下調(diào)，ABA 誘導(dǎo)基因表達(dá)上調(diào)，使根系中IAA 含量降低，ABA 含量明顯增加[24,44-45].在Cd 脅迫下，施加外源物會(huì)影響植物根系內(nèi)源激素的變化和相關(guān)基因的表達(dá)水平.朱瑞婷[24]研究指出，Cd脅迫下外源油菜素內(nèi)酯(EBR)處理的草地早熟禾，其根系中IAA 相關(guān)合成基因顯著上調(diào)，提高了根系中IAA 含量，緩解了Cd 脅迫對(duì)草地早熟禾根系的損傷.

在本研究中，Cd 脅迫蔞蒿根系中IAA 含量顯著降低了36.5%，ABA 含量明顯增加了70.7%(見(jiàn)圖1).這說(shuō)明Cd 脅迫下蔞蒿根系通過(guò)刺激ABA含量來(lái)調(diào)節(jié)根系細(xì)胞體積，改善根系形態(tài)，調(diào)控滲透壓，增強(qiáng)蔞蒿根系對(duì)Cd 脅迫的適應(yīng).接種促生菌蔞蒿根系中IAA 含量顯著增加了53.4%，ABA 含量下降了10.5%(見(jiàn)圖1).由此可見(jiàn)，促生菌的運(yùn)用調(diào)節(jié)了根系中IAA 和ABA 含量的變化，即可通過(guò)提高IAA 含量來(lái)緩解Cd 脅迫對(duì)蔞蒿根系的傷害.該結(jié)論與已有研究[24,44]相似，但有關(guān)Cd 脅迫與促生菌對(duì)蔞蒿根系中IAA 和ABA相關(guān)合成基因表達(dá)的影響有待進(jìn)一步探究.

圖1 不同處理組的蔞蒿根部IAA 和ABA 含量變化

3 結(jié)論

1)Cd脅迫下蔞蒿根系通過(guò)提高ABA的含量，增強(qiáng)了脯氨酸和甜菜堿的積累，刺激了根徑和根體積，賦予了其對(duì)Cd 脅迫的耐受性.

2)促生菌的運(yùn)用提高了蔞蒿根系中IAA 的含量，增強(qiáng)了可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的積累，促進(jìn)了根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和根表面積的增加，促進(jìn)了根系對(duì)土壤中P，K 和Fe 的吸收，緩解了Cd 脅迫對(duì)蔞蒿根系的傷害，能夠調(diào)控Cd 脅迫下蔞蒿根系的生長(zhǎng)發(fā)育.