陰道微環(huán)境及白介素-4與宮頸高危型人乳頭狀瘤病毒感染的相關(guān)研究

周源源，杜凌穎，齊夢(mèng)娟，郭 穎

（大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是誘發(fā)宮頸癌的主要病因。到目前為止，已鑒定出200多種HPV基因型，它們中的一些會(huì)感染生殖道，并具有較高的致癌潛力，稱為高危型HPV（high-risk human papilloma virus，HR-HPV），其中與宮頸癌相關(guān)性最高的為16型和18型〔1〕。陰道微環(huán)境對(duì)女性感染性傳播疾病過程有一定的影響，在宮頸病變過程中也發(fā)揮著重要的作用〔2〕，依賴于機(jī)體和微生物調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)平衡系統(tǒng)，與陰道菌群本身、微生物代謝產(chǎn)物及一系列反應(yīng)形成的局部免疫環(huán)境密切相關(guān)。評(píng)價(jià)體系分為形態(tài)學(xué)和功能性2個(gè)方面，形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)包括陰道菌群的密集度、多樣性以及優(yōu)勢(shì)菌、病原微生物等；功能性評(píng)價(jià)主要包括陰道pH值、H2O2濃度以及其他微生物代謝產(chǎn)物和酶類，其中任何一項(xiàng)指標(biāo)異常都可以判為陰道微生態(tài)失調(diào)〔3〕。陰道菌群結(jié)構(gòu)一旦遭到破壞，陰道內(nèi)的某些病原微生物就會(huì)大量繁殖，從而導(dǎo)致陰道微環(huán)境的改變。白介素-4（interleukin-4，IL-4）是一種多效性細(xì)胞因子，是調(diào)節(jié)機(jī)體Ⅱ型體液免疫反應(yīng)的特征性因子。IL-4不僅可以促進(jìn)Th2細(xì)胞分化、抑制Th1細(xì)胞增殖，還可以調(diào)節(jié)不同類型細(xì)胞的增殖、分化和凋亡〔4〕。IL-4在宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）1級(jí)（CINⅠ）和2級(jí)（CINⅡ）患者外周血中較健康對(duì)照人群明顯升高，引起全身免疫反應(yīng)。由此提示，在宮頸感染HRHPV后，IL-4可能參與宮頸從防御病毒入侵到發(fā)病的整個(gè)過程。故本研究探討陰道微環(huán)境及陰道灌洗液中IL-4水平與宮頸HR-HPV感染的相關(guān)性，為宮頸癌的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選取2018年12月至2019年12月在大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的宮頸HR-HPV感染的育齡期患者為觀察組（A組），共85例；根據(jù)分型檢測(cè)結(jié)果將HPV16型和/或18型患者歸入A1組（共40例，其中混合感染8例），非HPV16型或非HPV18型患者歸入A2組（45例）。選取同期在大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢的宮頸HPV檢測(cè)陰性者為對(duì)照組（B組），共83例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①宮頸HPV檢測(cè)結(jié)果為HR-HPV陽(yáng)性者；②有性生活史者；③既往HPV檢測(cè)陽(yáng)性未治療要求復(fù)查者；④因外陰瘙癢等癥狀就診者；⑤要求孕前檢查或常規(guī)體檢者；⑥自愿接受陰道分泌物及HPV檢測(cè)者。

1.2 方法

1.2.1 陰道菌群的識(shí)別及計(jì)數(shù) ①以濕片法查看滴蟲、假絲酵母菌和芽生孢子，同時(shí)判定陰道清潔度；②將干棉簽上取得的陰道分泌物涂片，干燥，固定后進(jìn)行革蘭氏染色；③在10×100倍油鏡下識(shí)別乳酸桿菌并計(jì)數(shù)分級(jí)；④在10×100倍油鏡下對(duì)乳酸桿菌、加德納菌、普雷沃菌和動(dòng)彎桿菌半定量評(píng)估，并進(jìn)行Nugent評(píng)分。

1.2.2 陰道pH值檢測(cè) 用干燥精密pH試紙（3.8～5.4）放置于陰道上1/3側(cè)壁，1 s后取出，與標(biāo)準(zhǔn)比色卡比對(duì)，得到陰道pH值。

1.2.3 陰道分泌物檢測(cè) 用陰道炎聯(lián)合檢測(cè)試劑盒檢測(cè)陰道分泌物中是否含有H2O2和白細(xì)胞酯酶。H2O2反應(yīng)孔不顯色或淡黃色或淺紅色計(jì)為陽(yáng)性，紅色或紫紅色計(jì)為陰性；白細(xì)胞酯酶反應(yīng)孔藍(lán)色計(jì)為陽(yáng)性，淡淺色或不顯色計(jì)為陰性。

1.2.4 IL-4檢測(cè) 取4 mL無血液的陰道灌洗液，用人IL-4酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒檢測(cè)每份灌洗液樣本的吸光度（OD）值，以標(biāo)準(zhǔn)品48、24、12、6、3、0 pg/mL對(duì)應(yīng)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本OD值計(jì)算每份樣本IL-4含量。

1.2.5 宮頸HPV分型檢測(cè) 采用人HPV分型檢測(cè)試劑盒，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-反向點(diǎn)雜交法進(jìn)行檢測(cè)，包括23種HPV分型，其中，17種HR-HPV分型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82型）和6種低危型HPV分型（6、11、42、43、81和83型）。1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較使用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較運(yùn)用單因素方差分析，多變量分析使用Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HR-HPV感染與年齡分布的關(guān)系168例納入研究的女性中，A組85例，B組83例，比較兩組女性的年齡，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。26～45歲女性HR-HPV感染率顯著低于年齡≤25歲和年齡＞45歲的女性，不同年齡段女性HR-HPV陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.910，P=0.001＜0.05）。見表1。

表1 HR-HPV感染與年齡分布的關(guān)系

2.2 HR-HPV感染與陰道微環(huán)境評(píng)價(jià)指標(biāo)的關(guān)系

2.2.1 陰道清潔度 根據(jù)白細(xì)胞酯酶活性判斷陰道清潔度。陰道清潔度Ⅰ～Ⅱ級(jí)為正常，計(jì)為陰性；陰道清潔度Ⅲ～Ⅳ級(jí)為異常，計(jì)為陽(yáng)性。A1組、A2組與B組3組之間陰道清潔度陽(yáng)性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.112，P＜0.05），其中，A1組和A2組的陽(yáng)性率均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A1組陽(yáng)性率高于A2組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2.2 乳酸桿菌 乳酸桿菌＋＋～＋＋＋提示陰道微生態(tài)正常，計(jì)為陽(yáng)性；乳酸桿菌＋或＋＋＋＋判定為陰道微生態(tài)失調(diào)，計(jì)為陰性。A1組、A2組與B組3組之間乳酸桿菌陽(yáng)性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.414，P＜0.05），其中，陽(yáng)性率B組最高，A1組最低。見表2。

2.2.3 pH值 陰道pH值≤4.5為正常，pH值＞4.5為異常。A1組、A2組與B組3組之間pH值異常率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.568，P＜0.05），其中，異常率A1組最高，B組最低。見表2。

2.2.4 H2O2根據(jù)陰道炎聯(lián)合檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，A1組、A2組與B組3組之間H2O2陽(yáng)性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.635，P＜0.05），其中，A1組和A2組的陽(yáng)性率均低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A1組陽(yáng)性率低于A2組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 HR-HPV感染與陰道微環(huán)境評(píng)價(jià)指標(biāo)的關(guān)系［n（%）］

2.3 HR-HPV感染與常見陰道炎的關(guān)系

2.3.1 滴蟲性陰道炎（trichomonas vaginitis，TV）168例納入研究的女性中，TV陽(yáng)性41例（占24.4%），其中，A1組18例（45.0%），A2組15例（33.3%），B組8例（9.6%）。A1組、A2組與B組3組之間TV陽(yáng)性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=30.670，P＜0.05）。

2.3.2 細(xì)菌性陰道 ?。╞acterial vaginosis，BV）168例納入研究的女性中，BV陽(yáng)性35例（占20.8%），A1組17例（42.5%），A2組13例（28.9%），B組5例（6.0%）。A1組、A2組與B組3組之間BV陽(yáng)性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.684，P＜0.05），其中，A1組和A2組的陽(yáng)性率均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A1組陽(yáng)性率高于A2組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 HR-HPV感染與陰道灌洗液中IL-4水平的關(guān)系比較3組陰道灌洗液中IL-4的水平，結(jié)果顯示，A1組含量最高，為（26.28±0.912）pg/mL，A2組含量次之，為（23.44±1.129）pg/mL，B組含量最低，為（7.61±0.479）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9 583.95，P＜0.05）。

2.5 多變量Logistic回歸分析以是否存在HRHPV感染為因變量，以乳酸桿菌、白細(xì)胞酯酶、TV、BV為自變量構(gòu)建Logistic回歸分析模型。以輸入法引入Logistic回歸方程進(jìn)行多因素非條件Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，乳酸桿菌、TV、BV、白細(xì)胞酯酶均是HR-HPV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 HR-HPV感染的Logistic回歸分析

3 討論

宮頸癌是世界第四大常見腫瘤，每年影響著約53萬(wàn)女性的健康〔5〕。近年來，我國(guó)宮頸癌發(fā)病率逐年增加，宮頸HR-HPV感染被認(rèn)為是宮頸癌發(fā)病的必然原因〔1〕。陰道微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，它的平衡與陰道菌群、陰道局部免疫功能等密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，HR-HPV感染有2個(gè)年齡高峰，分別是年齡≤25歲（占85.0%）和年齡＞45歲（占81.8%），這與De Sanjos等〔6〕對(duì)歐美女性的研究結(jié)果基本一致。由此說明，年齡≤25歲及年齡＞45歲的女性更易感染HR-HPV。

本次研究結(jié)果顯示，A1組、A2組與B組之間陰道清潔度陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明感染HR-HPV與陰道清潔度異常有相關(guān)性，與張旭梅等〔7〕研究結(jié)果一致。乳酸桿菌在維護(hù)陰道微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡上發(fā)揮著重要的作用，乳酸桿菌主要代謝產(chǎn)物是乳酸和H2O2，乳酸可以維持陰道正常pH。本研究顯示，A組與B組間的乳酸桿菌、pH值和H2O2比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），陰道乳酸桿菌陰性是HR-HPV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。乳酸桿菌、pH值在A1組與A2組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與喬嶠〔8〕及Clarke等〔9〕研究結(jié)果一致。說明乳酸桿菌的減少、pH值異常與HR-HPV的感染密切相關(guān)，尤其與HPV16型和/或18型感染顯著相關(guān)。

TV是性傳播疾病，需夫妻同治，否則易復(fù)發(fā)。陰道毛滴蟲定植后，使陰道微生態(tài)失調(diào)、陰道黏膜及局部免疫遭到破壞，加速HPV的侵入。Lazenby等〔10〕研究顯示TV與HR-HPV感染（特別是16型）顯著相關(guān)。本次研究結(jié)果顯示，TV陽(yáng)性率在A組與B組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TV陽(yáng)性是HRHPV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。TV陽(yáng)性率在A1組與A2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。BV是育齡期女性最常見的陰道炎之一，從微生物學(xué)角度看，BV的特點(diǎn)是陰道微生物區(qū)系改變，從以乳酸桿菌為主轉(zhuǎn)變?yōu)橛杉嫘詤捬鹾蛧?yán)格厭氧細(xì)菌組成的多微生物區(qū)系〔11〕。Haddad等〔12〕研究表明，BV在HPV、沙眼衣原體、淋球菌等病原體的傳播中起著促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，BV陽(yáng)性率在A組與B組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），BV陽(yáng)性是HR-HPV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。BV陽(yáng)性率在A1組與A2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與Haddad等〔12〕研究結(jié)果基本一致，說明感染BV的女性更易感染HR-HPV。

IL-4是調(diào)節(jié)機(jī)體Ⅱ型體液免疫反應(yīng)的特征性細(xì)胞因子，主要由Th2細(xì)胞分泌，同時(shí)，其又可以促進(jìn)Th2細(xì)胞分化。研究發(fā)現(xiàn)IL-4過度產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致如過敏性哮喘、特應(yīng)性皮炎、嗜酸性食管炎等過敏性疾病的發(fā)生〔13〕。正常情況下，Th1/Th2居于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)維持機(jī)體正常免疫功能，當(dāng)HPV侵入機(jī)體后，機(jī)體的免疫平衡被打破，Th2細(xì)胞及細(xì)胞因子增多。Sasagawa等〔14〕和Peghini等〔15〕的研究證實(shí)HPV感染后患者外周血的白介素-2（interleukin-2，IL-2）水平降低，白介素-10（interleukin-10，IL-10）水平明顯升高，說明HPV感染可能導(dǎo)致Th1/Th2失衡，Th2細(xì)胞分泌的IL-10濃度也因此升高。Sharma等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)CINⅠ、CINⅡ患者外周血中IL-4水平較健康對(duì)照組明顯升高。本研究中，A組陰道灌洗液中IL-4水平高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與Sharma等〔16〕研究結(jié)果一致。此外，IL-4水平在A1組與A2組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），由此說明，陰道灌洗液中IL-4的高水平狀態(tài)與HR-HPV感染有關(guān)，特別是HPV16型和/或18型的IL-4水平較其他HR-HPV分型更高。