PARVG基因在腎透明細(xì)胞癌患者中的表達(dá)及臨床意義

王立韜，白 麗*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000）

腎癌，即腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC），是一類起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤。從臨床角度看，RCC主要有3種病理類型：腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、腎乳頭細(xì)胞癌和腎嫌色細(xì)胞癌其中KIRC為最常見的病理類型，占RC C的70%～80%〔1-2〕。近年來，RCC的發(fā)病率逐年增加，在新增患者中，穩(wěn)居前10位（男性第6位，女性第8位），且發(fā)病呈現(xiàn)出年輕化的態(tài)勢〔3-4〕。RCC被認(rèn)為是一種免疫原性腫瘤，幾十年來免疫治療一直是其治療的重要部分〔5〕。目前，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）、單藥/聯(lián)用酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）顯示出更佳的臨床治療效果〔6〕。然而，ICIs仍然存在很多弊端，如不良反應(yīng)較多、容易產(chǎn)生耐藥等，因此，尋找新型靶點成為腫瘤免疫治療的關(guān)鍵所在。

PARVG基因是與焦點接觸相關(guān)的肌動蛋白結(jié)合蛋白家族中的一員，被證明可能是參與耐受過程的候選者〔7〕。PARVG基因主要在淋巴組織中優(yōu)先表達(dá)，全長約25 kb，定位于第22號染色體q13.31區(qū)域〔8〕。PARVG基因已被證明與大腸癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展無關(guān)，與子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后不良密切相關(guān)〔9-10〕。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)分析了人PARVG基因在KIRC和癌旁正常組織中的表達(dá)情況及對癌癥患者預(yù)后的影響，探討PARVG基因潛在的臨床價值，旨在為后續(xù)研究PARVG基因在KIRC的發(fā)生、發(fā)展、診療與預(yù)后以及研究新型治療靶點提供新的理論依據(jù)和信息支持。

1 材料與方法

1.1 TIMER數(shù) 據(jù) 庫TIMER（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）是一個包含32種常見腫瘤類型、對10 897個腫瘤進(jìn)行腫瘤浸潤免疫亞群預(yù)先計算的在線分析數(shù)據(jù)庫，可以方便快捷地獲取免疫浸潤與基因表達(dá)、體細(xì)胞突變、臨床結(jié)果等因素的聯(lián)系〔11〕。利用TIMER數(shù)據(jù)庫，在Diff Exp模式下搜索PARVG基因在臨床常見腫瘤中的表達(dá)情況。

1.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫GEPIA（https：//gepia.cancerpku.cn/index.html）是一個基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫，可以根據(jù)選定數(shù)據(jù)集和按癌癥類型或病理分期的統(tǒng)計方法繪制特定的基因表達(dá)譜，并可以對基因在某種特定癌癥中的表達(dá)及預(yù)后進(jìn)行分析的在線工具〔12〕。利用GEPIA對PARVG基因在KIRC患者中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，在Expression on Box Plots模式下，匹配的癌癥數(shù)據(jù)來自TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫，篩選及處理條件為：基因“1、數(shù)據(jù)集選擇“KIRC”、P＜0.01。

1.3 UALCAN數(shù)據(jù)庫UALCAN（https：//ualcan.path.uab.edu/analysis.html）是一個基于TCGA數(shù)據(jù)庫在線分析和挖掘的網(wǎng)站，可以分析在不同臨床病理特征下某個/某些基因在腫瘤樣本和癌旁正常組織樣本中的表達(dá)差異〔13〕。在UALCAN數(shù)據(jù)庫中選定TCGA數(shù)據(jù)庫為“Kidney renal clear cell carcinoma”，檢索PARVG基因的表達(dá)水平及KIRC患者腫瘤分期對患者預(yù)后的影響。

1.4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier Plotter（https：//kmplot.com/analysis/）數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)羅來自GEO、EGA和TCGA的癌癥患者生存信息及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，是對癌癥患者生存分析最權(quán)威的網(wǎng)站。利用此在線軟件在Pan-cancer RNA-seq模塊下，選擇“kidney renal clear cell carcinoma，n=530”，分 析PARVG基因?qū)IRC患者總體生存率的影響。

1.5 Coexpedia數(shù) 據(jù) 庫Coexpedia（https：//www.coexpedia.org/）是一個共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析以及可視化的在線工具，搜集了來自GEO數(shù)據(jù)庫關(guān)于人和小鼠的900多個數(shù)據(jù)集，并對每個數(shù)據(jù)集進(jìn)行了共表達(dá)分析，然后將共表達(dá)關(guān)系匯總成數(shù)據(jù)庫信息。通過在Coexpdia數(shù)據(jù)庫中檢索，獲得了在KIRC中PARVG基因的共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)。

1.6 Funrich軟件FunRich軟件主要用于基因和蛋白質(zhì)的功能富集和相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。選取Coexpedia數(shù)據(jù)庫得到的“LLS分?jǐn)?shù)＞2”的17個基因，在“Gene enrichment”模塊下，對17個基因進(jìn)行細(xì)胞組成（cellular component）、分子功能（molecular function）、生物學(xué)過程（biological process）以及生物學(xué)通路（biological pathway）的富集分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用單因素方差分析PARVG基因在KIRC腫瘤組織及癌旁正常組織中的表達(dá)差異；Kaplan-Meier Plotter研究PARVG基因表達(dá)與KIRC患者臨床預(yù)后的相關(guān)性（采用Log-rank檢驗）；用t檢驗或單因素方差分析PARVG基因差異表達(dá)；用皮爾遜法分析PARVG基因與其關(guān)鍵基因的表達(dá)相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PARVG基因在常見腫瘤中的表達(dá)情況利用TIMER數(shù)據(jù)庫分析PARVG基因在臨床常見腫瘤組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，PARVG基因在多種腫瘤組織及癌旁正常組織中呈現(xiàn)差異性表達(dá)，其中在乳腺浸潤癌（breast invasive carcinoma，BRCA）、結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、KIRC、腎乳頭細(xì)胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、肺鱗狀細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）、胃 腺 癌（stomach adenocarcinoma，STAD）以及子宮內(nèi)膜癌（uterinecorpus endometrial carcinoma，UCEC）中表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.001）。見圖1。

2.2 PARVG基因在KIRC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的樣本信息，分析了523例KIRC組織及100例癌旁正常組織中PARVG基因mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果表明，PARVG基因在KIRC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05）。見圖2。

圖2 PARVG在KIRC組織和癌旁正常組織中mRNA的表達(dá)情況

2.3 PARVG表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性利用UALCAN數(shù)據(jù)庫比較PARVG基因在不同腫瘤分期、腫瘤分級、不同種族、不同年齡階段間的表達(dá)差異。結(jié)果表明，PARVG基因在腫瘤1～4期KIRC患者腫瘤組織中的表達(dá)均明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01），且3期、4期PARVG基因表達(dá)水平均比1期的表達(dá)水平高（P＜0.01）。見圖3A。PARVG在白種人、非裔美國人以及亞洲人KIRC患者腫瘤組織中的表達(dá)水平均顯著高于癌旁正常組織（P＜0.01）。見圖3B。在年齡為21～40、41～60、61～80、81～100歲人群中，KIRC患者中PARVG基因的表達(dá)水平均明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01）。見圖3C。腫瘤1～4級的KIRC患者，PARVG基因的表達(dá)水平也顯著高于癌旁正常組織（P＜0.01），KIRC 3級與4級患者PARVG基因的表達(dá)水平均顯著高于2級患者（P＜0.01）。見圖3D。

圖3 PARVG表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性

注：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

2.4 PARVG基因與KIRC患者預(yù)后及生存性分析采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫評估PARVG基因的表達(dá)水平對KIRC患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)PARVG基因的高表達(dá)提示患者預(yù)后不良。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，高表達(dá)PARVG基因預(yù)示著KIRC患者更差的總體生存率（P=7.6×10-5，HR=2.2），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

圖4 PARVG基因?qū)IRC患者總體生存率的影響

2.5 PARVG與共表達(dá)基因在KIRC中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)利用Coexpedia數(shù)據(jù)庫繪制出PARVG基因與其共表達(dá)基因在KIRC中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，得到PARVG基因的共表達(dá)基因61個。其中LLS分?jǐn)?shù)＞2的共表達(dá)基因17個，分別是SASH3、SELPLG、ITGAL、CD84、CD53、RASSF5、MYO1F、LCP2、CD86、HCK、IL10RA、LY86、CD48、LILRB1、FCER1G、ARHGAP9和PRF1。

2.6 PARVG及其共表達(dá)基因的富集分析為進(jìn)一步了解PARVG基因與共表達(dá)基因在KIRC中的生物學(xué)功能，使用Funrich軟件對其進(jìn)行功能富集分析。通過細(xì)胞組成的富集分析，發(fā)現(xiàn)PARVG共表達(dá)基因主要參與了細(xì)胞質(zhì)膜的形成、維持細(xì)胞質(zhì)膜的完整性以及免疫突觸等方面。見表1。通過分子功能的富集分析，發(fā)現(xiàn)PARVG共表達(dá)基因中主要參與蛋白酪氨酸激酶活性、受體信號復(fù)合物支架活性、T細(xì)胞受體活性以及G蛋白信號活性調(diào)節(jié)因子等。見表2。通過生物學(xué)過程的富集分析，發(fā)現(xiàn)PARVG共表達(dá)基因中有7個基因（7/17，占41.18%）參與了細(xì)胞通訊，8個基因（8/17，占47.06%）參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。見表3。通過生物學(xué)通路的富集分析，發(fā)現(xiàn)PARVG共表達(dá)基因主要參與生理性止血、血管壁細(xì)胞表面的相互作用以及CXC R4介導(dǎo)的信號事件等多條信號通路。見表4。分析結(jié)果提示PARVG基因與其共表達(dá)基因可能通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)功能及信號傳導(dǎo)等過程來影響KIRC的發(fā)生與發(fā)展。

表1 PARVG共表達(dá)基因的細(xì)胞組成富集分析結(jié)果

表2 PARVG共表達(dá)基因的分子功能富集分析結(jié)果

表3 PARVG共表達(dá)基因的生物學(xué)過程富集分析結(jié)果

表4 PARVG共表達(dá)基因的生物學(xué)通路富集分析結(jié)果

3 討論

RCC占全球惡性腫瘤的2%～3%，據(jù)估計，全世界每年新增病例33.8萬例。大約20%～30%的患者在確診時即合并轉(zhuǎn)移，且患者5年內(nèi)復(fù)發(fā)的概率極高（可達(dá)90%）〔14〕，因此，尋找全新的診斷或治療靶點和標(biāo)志物成為目前亟待解決的問題。PARVG是來源于parvin家族的肌動蛋白結(jié)合蛋白，主要起著黏著斑蛋白的作用。PARVG的體細(xì)胞突變在少突膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中不起作用，只能觀察到PARVG的多態(tài)性改變〔15〕。

本研究基于生物信息學(xué)的分析方法，通過對TCGA數(shù)據(jù)庫的挖掘，探究PARVG基因在KIRC中潛在的臨床應(yīng)用價值。通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析

PARVG基因在常見腫瘤中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PARVG基因在乳腺浸潤癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸腺癌、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭細(xì)胞癌、胃腺癌以及子宮內(nèi)膜癌等多種實體瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)。通過GEPIA及UALCAN數(shù)據(jù)庫分析PARVG基因mRNA在KIRC組織中的表達(dá)水平及預(yù)后情況。結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，PARVG基因在KIRC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果顯示，PARVG基因的表達(dá)水平與患者預(yù)后具有相關(guān)性，PARVG基因表達(dá)水平越高，患者的總體生存率越差，說明PARVG基因的高表達(dá)可能與KIRC患者預(yù)后不良有關(guān)，PARVG基因的表達(dá)水平可作為判斷患者預(yù)后的一個指標(biāo)用于臨床診療中。

為探究PARVG基因參與調(diào)控的生物學(xué)過程，利用Coexpedia數(shù)據(jù)庫進(jìn)行挖掘，并利用Funrich軟件著重對LLS分?jǐn)?shù)＞2的共表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，獲得了其在細(xì)胞組成、分子功能、生物學(xué)過程及生物學(xué)通路中發(fā)揮的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PARVG基因參與了多種生物學(xué)過程。在PARVG基因的共表達(dá)基因中，SELPLG、CD84、CD48、FCER1G主要參與細(xì)胞質(zhì)膜的形成，并在細(xì)胞質(zhì)膜的完整性保持方面發(fā)揮重要作用。另外，共表達(dá)基因HCK、LCP2、LY86、RASSF5等參與了多種信號通路的活化與信號傳導(dǎo)等過程。SASH3、ITGAL、CD84、CD53、CD86、LILRB1、FCER1G等共表達(dá)基因參與了免疫應(yīng)答的調(diào)控過程，免疫應(yīng)答在腫瘤控制中起到了至關(guān)重要的作用。SELPLG、ITGAL、CD84、CD48、FCER1G等則參與了生理性止血與血管壁細(xì)胞表面的相互作用等多種生物學(xué)通路。PARVG基因與其共表達(dá)基因可能通過相互作用影響免疫應(yīng)答、信號傳導(dǎo)等共同參與調(diào)控KIRC的發(fā)生、發(fā)展。

本研究基于多種生物信息學(xué)在線工具探究了PARVG基因在KIRC中的表達(dá)情況以及預(yù)后意義。PARVG基因在KIRC組織中高表達(dá)，同時其高表達(dá)與患者的總體生存率密切相關(guān)。另外，PARVG基因在腫瘤相關(guān)的多種生物學(xué)過程及信號傳導(dǎo)中也發(fā)揮著舉足輕重的作用。因此，PARVG基因有望成為KIRC臨床研究及治療的潛在靶基因。