藏區(qū)瀕危藥用植物獨一味的葉綠體基因組特征

蒲 芬，張德全，2*

（1.大理大學藥學院，云南大理 671000；2.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室（培育），云南大理 671000）

獨一味Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo為唇形科獨一味屬的單種屬植物〔1〕，主要分布在青海、甘肅、四川、西藏等省的高海拔地區(qū)〔2〕。獨一味是藏族的習用藥用植物，以其干燥地上部分入藥，藏語稱“大巴”或“打布巴”。由于該物種受到嚴重采挖及破壞，資源日趨瀕危，被建議列為青藏高原瀕危藏藥物種〔3〕。該藥材還被2020年版《中華人民共和國藥典》收錄，具有止血、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、增強免疫等作用〔4-7〕。獨一味的化學成分包括黃酮類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類、揮發(fā)油類等〔8-9〕。目前，國內(nèi)外對獨一味的研究較多，但主要集中在化學成分、藥理、藥效、臨床應用等方面，而分子生物學方面的研究較少。潘正〔10〕基于核糖體內(nèi)轉錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer 2，ITS2）條形碼和代謝組技術對藏藥獨一味的品質進行評價，結果表明，獨一味與其代用品美花圓葉筋骨草Ajuga ovalifolia和藏玄參Oreosolen wattii的ITS2條形碼存在明顯的差異，ITS2可以作為鑒定獨一味及其代用品的DNA條形碼。Wang等〔11〕也利用ITS2成功地鑒定了獨一味及其偽品藥材。Liu等〔12〕利用區(qū)間簡單重復序列（inter-simple sequence repeats，ISSR）標記及隨機擴增多態(tài)性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）分子標記技術對西藏、青海、云南等地獨一味的遺傳多樣性及居群遺傳結構進行分析，發(fā)現(xiàn)獨一味的遺傳變異程度較高。但是，目前還沒有關于獨一味葉綠體全基因組序列方面的研究報道。

葉綠體基因組因結構簡單、相對分子量小、保守性好〔13〕，被廣泛應用于物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析。在分子鑒定方面，葉綠體基因組可以作為物種鑒定的超級條形碼以及從中篩選高變片段作為物種鑒定的潛在分子標記〔14-15〕；在系統(tǒng)發(fā)育方面，葉綠體基因組可有效揭示物種系統(tǒng)發(fā)育位置及近緣種間的親緣關系〔14〕。He等〔16〕對廣藿香Pogostemon cablin的葉綠體全基因組進行了報道，發(fā)現(xiàn)廣藿香的基因結構、GC含量及密碼子偏好性與同屬物種很相似。Cui等〔17〕對荔枝草Salvia plebeia的葉綠體基因組進行了報道，對荔枝草及已發(fā)表的5個同屬物種的結構和序列進行比較，并揭示了荔枝草的系統(tǒng)發(fā)育關系。此外，與DNA通用條形碼相比，葉綠體全基因組包含更豐富的變異位點，物種鑒定效率更高，被視為新一代DNA條形碼〔18〕。

本研究利用二代高通量測序技術對獨一味進行測序，經(jīng)組裝、注釋，得到一條完整的葉綠體全基因組序列。對該基因組的序列特征進行解析，與唇形科中5種重要藥用植物的葉綠體基因組進行比較分析，并聯(lián)合唇形科中29條已發(fā)表序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，為獨一味的物種鑒定、資源保護及系統(tǒng)進化等研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本研究中二代測序所用的分子材料為硅膠干燥的獨一味葉片，采自云南省迪慶藏族自治州德欽縣白馬雪山丫口附近（28°21′57.36″N，99°01′44.34″E，海拔4 197 m）。憑證標本經(jīng)大理大學藥學院生藥教研室張德全教授鑒定為唇形科獨一味屬植物獨一味Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo，編號為ZDQ20015，該標本保存于大理大學藥學院藥用植物與生藥標本館。

1.2 總基因組DNA提取、測序 采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法，從硅膠干燥的葉片中提取DNA，用超聲波破碎儀將DNA片段化，經(jīng)末端修復、片段純化、加A尾、接測序接頭、PCR擴增等過程，形成測序文庫。再使用帶有雙末端pair-end（2×300 bp）文庫Illumina Hi S eq 2500平臺進行測序，整個測序工作由上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3 葉綠體全基因組組裝、注釋 測序完成后得到原始數(shù)據(jù)，使用Trimmomatic v.0.32軟件進行過濾，以益母草（Leonurus japonicus，登錄號：NC_038062.1）為參考序列，使用GetOrganelle.py進行組裝。再使用Geneious 8.0.2軟件對組裝得到的葉綠體全基因組序列進行注釋，并將最終結果提交至美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫（登錄號：MW322685），利用OGDRAW在線軟件（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）繪制獨一味葉綠體基因組的物理圖譜。

1.4 簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）分析 獨一味葉綠體基因組中SSR使用MISA軟件進行分析。參數(shù)設置為單堿基重復最短為10個，二堿基重復最短為5個，三堿基重復最短為4個，四堿基重復最短為4個，五堿基重復最短為3個，六堿基重復最短為3個。

1.5 密碼子偏好性分析 采用CondonW 1.4.2軟件對獨一味葉綠體基因組的密碼子偏好性進行分析，獲得相關參數(shù)，包括第三位上的GC堿基含量（GC3s）、GC含量、相對同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）以及有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）。

1.6 葉綠體基因組比較 將獨一味葉綠體基因組與NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的5種唇形科植物序列（黃芩Scutellariabaicalensis、薄荷Menthacanadensis、丹參Salvia miltiorrhiza、水蘇Stachys japonica、線紋香茶菜Isodon lophanthoides）進行對比。利用Excel統(tǒng)計葉綠體基因組的總基因數(shù)、GC含量、大單拷貝區(qū)（large single copy，LSC）、小單拷貝區(qū)（small single copy，SSC）、反向重復區(qū)（inverted repeats，IR）的長度等結構特征信息。使用在線工具IRscope（https：//irscope.shinyapps.io/irapp/）對葉綠體基因組IR區(qū)比較分析。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載已發(fā)表的29種唇形科植物的葉綠體基因組，包括百里香屬Thymus（T.japonicus，T.mongolicus）、黃芩屬Scutellaria（S.insignis，S.tsinyunensis，S.baicalensis，S.mollifolia）、紫 蘇 屬Perilla（P.setoyensis，P.frutescensvar.hirtella）、薄 荷 屬Mentha（M.canadensis，M.spicata，M.longifolia，M.piperita）、鼠尾 草 屬Salvia（S.chanryoenica，S.plebeia，S.japonica，S.miltiorrhiza）、羅 勒 屬Ocimum（O.tenuiflorum，O.basilicum）、水 蘇 屬Stachys（S.japonica，S.chamissonis）、香 科 科 屬Teucrium（T.omeiense，T.simplex）、香 茶 菜 屬Isodon（I.rubescens，I.serra，I.lophanthoides）以及筋骨草屬Ajuga（A.forrestii，A.lupulina，A.decumbens，A.cilita）。以爵床科馬藍屬的板藍Strobilanthes cusia作為外類群。使用MAFFT v.7.1軟件將獨一味的葉綠體基因組序列與29種唇形科植物的序列進行對比，并使用jModelTest v.2.1.7軟件篩選最佳核苷酸替代模型，篩選出最佳核苷酸模型為GTR+I+G。采用貝葉斯法（Bayesian，BI）和最大似然法（maximum likelihood，ML）進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建。BI樹利用MrBayes v.3.2.6軟件進行構建，馬爾可夫鏈蒙特卡洛（MCMC）算法計算100萬代，每隔1 000代取樣1次，舍棄前25%的樹，根據(jù)剩余的樣本構建一致樹；ML樹利用RAxML v.8.2.4軟件進行構建，采用快速靴帶算法進行計算，重復1 000次。

2 結果與分析

2.1 葉綠體基因組基本特征 獨一味的葉綠體基因組呈典型的四分體結構，見圖1，全長151 808 bp，其中LSC長83 126 bp，SSC長17 396 bp，一對IR長25 643 bp。全基因組的GC含量為38.5%，IR的GC含量（43.4%）高于SSC（32.6%）和LSC（36.6%）。獨一味葉綠體基因組序列共編碼107個基因，包括蛋白質編碼基因79個，rRNA基因4個，tRNA基因23個，假基因1個（rps19）。該葉綠體基因組序列有11個基因含有內(nèi)含子，其中2個基因（ycf3、clpP）含有2個內(nèi)含子，其余9個基因（rps16、atpF、rpoC1、petB、petD、rpl16、rpl2、ndhB、ndhA）含 有1個內(nèi)含子。獨一味葉綠體全基因組基因組成見表1。

表1 獨一味葉綠體全基因組基因組成

圖1 獨一味葉綠體全基因組物理圖譜

2.2 SSR分析 獨一味葉綠體基因組中共檢測到54個SSR，包括31個單核苷酸重復序列，9個二核苷酸重復序列，3個三核苷酸重復序列，10個四核苷酸重復序列，1個五核苷酸重復序列。SSR最豐富的類型為單核苷酸重復序列，而單核苷酸重復序列又以A和T堿基為主。

2.3 密碼子偏好性分析 利用CondonW 1.4.2軟件對獨一味葉綠體基因組的密碼子偏好性進行分析。結果顯示，獨一味葉綠體基因組的ENC值為55.93，更偏向于61.00，說明獨一味葉綠體基因組的密碼子偏好性較弱。此外，該葉綠體基因組的GC3s含量為36.6%，GC含量為38.5%，兩者均小于50.0%，說明獨一味葉綠體基因組偏向使用A和T兩種堿基。對該葉綠體基因組的RSCU值進行分析，RSCU值＞1的密碼子有32個，其中以A和U堿基結尾的密碼子有27個（占84.4%），說明編碼獨一味葉綠體基因組的密碼子偏好以A和U堿基結尾。該葉綠體基因組共有61種密碼子，編碼20種氨基酸，所有注釋基因共由50 902個密碼子編碼，其中編碼亮氨酸的密碼子最多，共有4 966個；編碼色氨酸的密碼子最少，共有670個。

2.4 基因組基本特征比較 唇形科6種藥用植物的葉綠體基因組長度為150 599～152 731 bp，GC含量均為38.0%左右，基因總數(shù)略有不同。LSC占序列長度的絕大部分，其長度為81 701～83 950 bp，其中黃芩的LSC最長。SSC長度為17 396～17 700 bp，IR長度為25 539～25 700 bp，其中線紋香茶菜的SSC及IR最長。見表2。

表2 獨一味與唇形科其他5種藥用植物葉綠體基因組的基本特征

2.5 IR邊界分析 葉綠體基因組普遍存在擴張和收縮的現(xiàn)象，且不同物種間存在不同程度的差異。對唇形科6種藥用植物葉綠體基因組IR邊界進行分析，研究表明，位于IR邊界的基因有rps19、rpl2、ycf1、ndhF。所有物種的IRb-SSC邊界均在ndhF基因內(nèi)，SSC-IRa邊界均在ycf1基因內(nèi)。rpl2基因位于IR，trnH基因位于LSC，距邊界均有一段距離。rps19位于4種植物的LSC-IRb邊界上，而在薄荷及線紋香茶菜中位于LSC，距邊界均為87 bp。見圖2。

圖2 唇形科6種藥用植物葉綠體基因組IR邊界分析

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析 本研究中基于獨一味與唇形科29條葉綠體基因組構建的BI樹與ML樹，其拓撲結構基本一致，各分支節(jié)點的支持率均為100%，可信度較高。外類群板藍最先從系統(tǒng)發(fā)育樹中分化出來。此系統(tǒng)發(fā)育樹聚為兩支：香茶菜屬Isodon、羅勒屬Ocimum、紫蘇屬Perilla、薄荷屬Mentha、百里香屬Thymus、鼠尾草屬Salvia聚為一支，而黃芩屬Scutellaria、水蘇屬Stachys、獨一味屬Lamiophlomis、筋骨草屬Ajuga、香科科屬Teucrium聚為另一支。獨一味屬與水蘇屬親緣關系最近，其次為黃芩屬。見圖3。

圖3 基于葉綠體全基因組構建獨一味與相關物種的BI樹與ML樹

3 討論

本研究首次報道了獨一味葉綠體基因組，并對其葉綠體基因組特征進行了解析。結果顯示，獨一味的葉綠體基因組全長151 808 bp，GC含量為38.5%，共編碼了107個基因，結果與大多數(shù)被子植物的葉綠體基因組特征相似。對唇形科6種藥用植物葉綠體基因組特征進行比較，葉綠體基因組長度為150 599～152 731 bp，GC含量均為38.0%左右，說明唇形科葉綠體基因組的長度與GC含量具有保守性。在葉綠體基因組進化過程中，IR區(qū)邊界會發(fā)生收縮和擴張，本研究位于IR邊界的基因有rps19、rpl2、ycf1、ndhF，所有物種的IRb-SSC邊界均在ndhF基因內(nèi)，SSC-IRa邊界均在ycf1基因內(nèi)，說明唇形科的IR邊界較為保守，這與沈立群〔19〕研究結果相類似。

密碼子偏好性在自然界中廣泛存在。目前，密碼子偏好性研究在許多生物學領域受到關注，如預測基因表達水平、優(yōu)化基因表達、揭示基因進化規(guī)律等領域〔20〕。對獨一味的密碼子偏好性進行分析，結果顯示，RSCU值＞1的密碼子有32個，其中以A和U堿基結尾的密碼子有27個，占84.4%，偏好以A和U堿基結尾，這與苦蕎Fagopyrum tataricum〔21〕、苦豆子Sophora alopecuroides〔22〕等雙子葉植物中葉綠體密碼子偏好以A和U堿基結尾的結果相一致。

獨一味的地上部分是一味傳統(tǒng)藏藥，具有活血化瘀、消腫止痛的功效。美花圓葉筋骨草、藏玄參等植物與獨一味形態(tài)相似，易于混淆，常作為藥材獨一味的代用品〔11〕。本研究對獨一味的葉綠體基因組特征進行了分析，為獨一味與其代用品的分子鑒定提供了理論依據(jù)。本研究基于唇形科葉綠體基因組序列，構建了11個屬30個種的系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明，獨一味屬與水蘇屬親緣關系最近，其次為黃芩屬，這支持傳統(tǒng)的分類處理〔1〕。但是，傳統(tǒng)分類中同屬于野芝麻亞科的紫蘇屬、薄荷屬、百里香屬、鼠尾草屬、水蘇屬、獨一味屬并未聚在一起，本研究結果更支持Li等〔23〕基于分子證據(jù)對這些類群的分類處理。本研究首次對獨一味屬植物（單種屬）進行葉綠體全基因組報道，對瀕危藥用植物獨一味的資源利用和保護、獨一味屬與近緣屬間系統(tǒng)發(fā)育關系的探討都提供了科學依據(jù)。