滇西33種菊科植物體外降脂活性研究

郎利娟，崔淑君，朱起杰，3，楊 麗，3，王 影，3，姜 北，3，肖朝江，3*

（1.大理大學藥物研究所，云南大理 671000；2.大理大學藥學院，云南大理 671000；3.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室（培育），云南大理 671000；4.畢節(jié)醫(yī)學高等?？茖W校，貴州畢節(jié) 551700）

脂質(zhì)代謝紊亂俗稱血脂異?；蚋咧Y，是指血液中總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）或甘油三酯（TG）中的一項或多項過高，或伴有高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平過低為特征的一類代謝性疾病。脂質(zhì)代謝紊亂與糖尿病、阿爾茨海默病、肥胖、癌癥和動脈粥樣硬化性心血管疾病等多種疾病的病理有關〔1-2〕。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2016年估計有1 790萬人死于心血管疾病，占全球死亡總數(shù)的31%；非傳染性疾病導致的1 700萬70歲以下死亡人群中，37%由心血管疾病造成〔3〕。研究表明，血脂異常能顯著增加心血管疾病的患病率和病死率〔1-2〕。因此，降低血脂可以有效地干預動脈粥樣硬化的進展，減少心血管疾病的風險。

菊科（Compositae）植物全球約有1 000屬，2.5萬～3萬種，廣泛分布于世界各地。我國約有200余屬，2 000多種，遍布全國各地，種類繁多，且許多種類富有經(jīng)濟價值，如萵苣、萵筍、茼蒿、菊芋等為日常食用蔬菜，向日葵、小葵子、蒼耳的種子可榨取食用或工業(yè)用油，橡膠草和銀膠菊可提取橡膠〔4〕。此外，許多菊科植物還具有良好的降脂活性。例如，菊科植物Solidago chilensis醇提物及其主成分槲皮素具有降低膽固醇和預防動脈粥樣硬化的作用〔5〕；Launaea taraxacifolia的葉具有顯著的體外降脂活性〔6〕；北艾Artemisia vulgaris具有降血脂、抗炎、抗氧化作用，可作為預防動脈粥樣硬化和心血管疾病的藥物〔7〕；蓍Achillea millefolium的甲醇提取物和水提物對四氧嘧啶誘導的糖尿病大鼠具有顯著的抗高血糖和降血脂活性〔8〕；白蓮蒿Artemisia sacrorum95%乙醇提取物能顯著降低人肝癌細胞HepG2的脂質(zhì)積累〔9〕；含有紅花Carthamus tinctorius提取物的丹紅注射液能明顯增加肝臟脂肪分解，減少脂肪酸合成〔10〕。

為從植物中發(fā)現(xiàn)高效、低毒副作用的新型降脂藥物，本研究通過高脂細胞模型對采自滇西的33種菊科植物進行體外降脂活性篩選，以期能發(fā)現(xiàn)活性較好的藥用植物，為尋找植物來源的新型降脂天然產(chǎn)物奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器BSC－1000-Ⅱ-A2生物安全柜（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；5510E CO2培養(yǎng)箱（美國NuAire公司）；DT5－6低速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）；M700E倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Varioskan LUX多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Coolsafe 95－15冷凍干燥機（丹麥Labo Gene公司）；AL204電子天平（梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司）；HVE－50高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）；DW－86L628－80℃低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）；RE－5205旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 細胞株和試藥人肝癌細胞HepG2由中國科學院昆明植物研究所黎勝紅研究員惠贈；Gibco RPMI 1640干粉培養(yǎng)基（批號：2126369）、Gibco澳洲特級胎牛血清（FBS，批號：1414426）均購自美國Invitrogen公司；細胞培養(yǎng)級二甲基亞砜（DMSO，批號：RNBF6155）購自美國Sigma公司；4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，批號：513C046）、青霉素－鏈霉素溶液（批號：20190125）、胰蛋白酶－乙二胺四乙酸消化液（批號：20190819）均購自北京索萊寶科技有限公司；油酸（OA，批號：C10375483）、油紅O（批號：C10096989）均購自上海麥克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA，批號：EZ6789D116）購自德國Biofroxx公司；棕櫚酸鈉（PA，批號：C04D10A104981）購自上海源葉生物科技有限公司；辛伐他?。ㄅ枺篧ZG110808－039N）購自美國Ark Pharm公司；CCK－8試劑盒（批號：20200701）購自杭州弗德生物科技有限公司。

1.3 植物樣品33種菊科植物樣品均采自滇西地區(qū)，由大理大學藥學院生藥教研室張德全教授鑒定，植物標本現(xiàn)均存放于大理大學藥物研究所。植物信息見表1。

表1 33種菊科植物樣品的基本信息

2 方法

2.1 植物提取物的制備33種菊科植物樣品干燥后粉碎，75%乙醇回流提取3次，合并后的提取液用旋轉蒸發(fā)儀在50℃以下除去乙醇，轉移至冷凍干燥機上冷凍干燥，得相應凍干粉，備用。

2.2 細胞活力檢測參考文獻〔11〕方法，采用CCK－8試劑盒進行細胞活力檢測。簡要步驟如下：HepG2細胞以1.5×104個/孔的密度接種于96孔板，置于37°C、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h。設置空白組、陰性對照組、供試組（模型組和給藥組）?？瞻捉M無細胞，僅含同體積RPMI 1640培養(yǎng)基；陰性對照組含細胞，不加誘導劑和各提取物；模型組含細胞和誘導劑；給藥組含細胞、誘導劑和各提取物。誘導劑為經(jīng)40%BSA結合的0.6 mmol/L OA和0.3 mmol/L PA；各提取物終濃度為0.5 mg/mL。培養(yǎng)24 h后，向每孔加入10μL CCK-8溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用酶標儀測定各組在450 nm處的吸光度（OD）。細胞活力按以下公式計算：細胞活力（%）=［（供試組OD值-空白組OD值）/（陰性對照組OD值-空白組OD值）］×100%。

2.3 體外降脂活性測試參考文獻〔12〕方法，進行體外降脂活性測試。簡要步驟如下：HepG2細胞以1.5×104個/孔的密度接種于96孔板，置于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，細胞豐度達90%以上時，將舊培養(yǎng)液（含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液）更換為含誘導劑的新鮮培養(yǎng)液，陰性對照組換為含有與誘導劑同體積的40%BSA培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，給藥組每孔加入20μL提取物溶液，終濃度為0.5 mg/mL，空白組與模型組每孔加入20μL相應溶媒（植物提取物溶媒為滅菌超純水，辛伐他汀溶媒為DMSO）。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，小心移除孔內(nèi)培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1次，每孔加入60μL 10%的甲醛溶液。固定30 min，移除固定液，PBS清洗1次，每孔加入60μL 0.4 mg/mL油紅O工作液染色。60 min后，移除染色液，PBS沖洗3次，置倒置顯微鏡下觀察細胞內(nèi)脂滴染色情況。最后每孔加入200μL異丙醇（分析純），充分溶解后，酶標儀測定波長510 nm處各組的OD值。降脂率按以下公式計算：降脂率（%）=［1-（給藥組OD值-空白組OD值）/（模型組OD值-空白組OD值）］×100%。

2.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

細胞活力檢測結果表明，在0.5 mg/mL濃度下，除多花百日菊給藥組細胞幾乎全部死亡外，其余植物提取物均無明顯的細胞毒性。體外降脂活性篩選結果顯示，陽性藥物辛伐他汀終濃度為50μmol/L時，無細胞毒性，體外降脂率為（11.4±2.9）%。篩選的27屬33種菊科植物中有19屬24種（占比70%以上）具有不同程度的降脂活性；其中降脂率大于10%的有10屬、12種，約占1/3。在篩選出的具有降脂活性的植物中，熊膽草、紫莖澤蘭降脂活性最好，體外降脂率分別為（18.4±1.9）%、（18.4±9.7）%，其次是狼杷草和腫柄菊，體外降脂率分別為（17.5±10.2）%、（15.1±13.4）%，此4種菊科植物提取物與辛伐他汀體外降脂率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 33種菊科植物體外降脂活性篩選結果（x±s，n=4）

4 討論

血脂異常是心血管疾病發(fā)生及發(fā)展的主要因素之一。對于中高風險的高脂血癥患者，可以通過改變不健康的生活方式和藥物干預進行降脂。目前，傳統(tǒng)的調(diào)血脂藥物主要有他汀類、貝特類、煙酸類、依折麥布、膽汁酸螯合劑等，隨著研究的不斷深入，一些新型調(diào)血脂靶點和降血脂藥物逐漸被發(fā)現(xiàn)。在脂質(zhì)代謝中，除了著名的羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG－CoA）外，前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（PCSK9）、載脂蛋白B（ApoB）、載脂蛋白C-Ⅲ（ApoC－Ⅲ）、微粒體甘油三酯轉移蛋白（MTP）、ATP檸檬酸裂合酶（ACL）、血漿膽固醇酯轉運蛋白（CETP）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα），以及人血管生成素樣蛋白（ANGPTL）等均扮演著重要角色，但是無論是傳統(tǒng)調(diào)血脂藥物還是新型降血脂藥物都具有諸多局限性及不良反應〔13－14〕，因此，尋找安全、高效的新型降血脂藥物已然成為一項長期且艱巨的研究。

據(jù)文獻報道，目前已從腫柄菊中分離得到了以倍半萜和黃酮類化合物為主的100多個化合物，同時還發(fā)現(xiàn)其葉的水提物具有顯著的大鼠體內(nèi)降血脂活性〔15〕，這與本研究腫柄菊地上部分醇提物具有較好的體外降脂活性結果一致。研究還表明，腫柄菊的降脂活性物質(zhì)基礎可能并非其主成分，而是皂苷類成分〔15〕。狼杷草主要含黃酮類化合物，其次為聚炔類特征成分〔16〕。根據(jù)現(xiàn)有的研究報道，黃酮類成分多通過干擾脂質(zhì)吸收和合成、誘導脂質(zhì)代謝等發(fā)揮降脂活性〔17〕，因此推測其可能為狼杷草的降脂物質(zhì)基礎。熊膽草的主要成分為齊墩果烷型三萜皂苷類化合物，此外還含有黃酮、二萜及其糖苷類等成分〔18〕，降脂成分為皂苷類還是黃酮類化合物，有待進一步驗證。紫莖澤蘭主要含暫未見降脂活性報道的杜松烷型倍半萜類化合物，其次為綠原酸衍生物，以及少量黃酮等其他成分〔19〕，故其降脂活性成分和機制還有待深入研究。

本研究中體外降脂活性較好的黃花蒿、野艾蒿同屬植物豬毛蒿Artemisia capillaris水提物具有較好的大鼠體內(nèi)降脂活性〔20〕；鬼針草、狼杷草同屬植物Bidens odorata乙醇提取物及其中糖苷類化合物具有較好的小鼠體內(nèi)降脂活性〔21〕；推測菊科蒿屬和鬼針草屬植物的降脂活性可能較同科其他屬植物強，并在一定程度上具有普遍性。本研究篩選出12種植物具有較好的降脂活性（降脂率大于10%），然而僅腫柄菊有降脂活性報道，提示這些菊科植物具有較大的后續(xù)深入研究價值和潛力。此外，豨薟和云南蒿等植物出現(xiàn)降脂率為負數(shù)情況，鏡檢發(fā)現(xiàn)，這些植物可能具有一定的促進脂質(zhì)堆積或促進細胞增殖作用，抑或兩種作用同時存在。