越南伯克霍爾德氏菌B418配合噻唑膦提高對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲的防控效果

扈進(jìn)冬 魏艷麗 王貽蓮 劉寶軍 李紀(jì)順

〔齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省科學(xué)院生態(tài)研究所，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250103〕

根結(jié)線蟲是世界上危害植物健康最嚴(yán)重的寄生線蟲之一，目前已知對(duì)5 500 多種植物的生長(zhǎng)發(fā)育及生產(chǎn)構(gòu)成威脅，其中包括糧食作物、蔬菜作物及經(jīng)濟(jì)作物等（Trudgill &Blok，2001；Jones et al.，2013）。在我國(guó)南方根結(jié)線蟲（）、花生根結(jié)線蟲（）、爪哇線蟲（）和北方根結(jié)線蟲（）4 種根結(jié)線蟲分布比例最高（Castagnone-Sereno et al.，2013；Fan et al.，2020）。伴隨著我國(guó)保護(hù)地蔬菜的迅猛發(fā)展，黃瓜、番茄等根結(jié)線蟲危害日趨嚴(yán)重，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。北方保護(hù)地黃瓜生產(chǎn)中根結(jié)線蟲以南方根結(jié)線蟲為主，一旦發(fā)生常導(dǎo)致黃瓜嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)，是影響黃瓜生產(chǎn)的重要病害之一（彭德良，1998；成惠珍 等，2004；賈美清和吳光紅，2011）。然而目前市場(chǎng)上可供選擇的殺線劑主要以噻唑膦、阿維菌素、棉隆為主，在很多地方已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性（劉曉艷 等，2021）。農(nóng)民為了防治根結(jié)線蟲病，實(shí)際的化學(xué)殺線劑使用量也逐漸增加，不但增加了防治成本，而且也易產(chǎn)生藥害、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染（紀(jì)春濤 等，2010；Davies &Spiegel，2011；Sergio，2011），同時(shí)，防治效果和產(chǎn)量也提高有限。由于化學(xué)防治的局限性，以及人們環(huán)境保護(hù)、食品安全意識(shí)的提高，生物防治已被認(rèn)為是化學(xué)防治的一種有益補(bǔ)充及替代方法。在生物防治措施中，微生物拮抗劑是一種很有前景的防治植物病害的生物制劑，也越來越受到人們的廣泛關(guān)注（Sharifazizi et al.，2017；Vega，2018）。目前已報(bào)道的植物寄生線蟲生防微生物資源有淡紫擬青霉251、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌I-1582、厚垣輪枝孢ZK7（Li et al.，2015）、長(zhǎng)枝木霉T6（Zhang et al.，2017）、橘綠木霉Snef 1910（Fan et al.，2020）、越南伯克霍爾德氏菌B418（陳凱 等，2011）等，其中多株優(yōu)良生防菌株已被開發(fā)為生物殺線劑產(chǎn)品。

越南伯克霍爾德氏菌B418 是山東省科學(xué)院生態(tài)研究所環(huán)境微生物研究室保存的一株多功能生防菌株，除具備防治植物根結(jié)線蟲病的作用，還兼有解磷、解鉀、固氮、促生等功能，并已在農(nóng)業(yè)部登記為微生物肥料產(chǎn)品（王貽蓮 等，2014）。在以往的試驗(yàn)中主要單獨(dú)使用，對(duì)線蟲的防治效果還不甚理想，因此本試驗(yàn)擬通過小區(qū)試驗(yàn)測(cè)定越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦使用對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲的田間防治效果及產(chǎn)量的影響，為黃瓜根結(jié)線蟲病的科學(xué)防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和藥劑

越南伯克霍爾德氏菌B418（CGMCC No.1212）由山東省科學(xué)院生態(tài)研究所環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室保存，液體發(fā)酵后制備成粉狀菌劑（活菌含量5 × 10cfu·g）備用。10%噻唑膦顆粒劑（河北三農(nóng)農(nóng)用化工有限公司產(chǎn)品）按1∶9 比例與細(xì)沙混合備用。

1.2 土壤樣品采集與土壤DNA 提取

2021 年在山東省泰安市岱岳區(qū)明泰農(nóng)豐科技（泰安市）有限公司大棚采集土壤樣品，該棚棚齡11 年，土壤類型為棕壤。試驗(yàn)棚劃分小區(qū)后，每小區(qū)按照五點(diǎn)取樣法取樣，采集0～20 cm 的表層土，將5 點(diǎn)采集的土壤混合均勻作為1 個(gè)土樣。室溫條件下風(fēng)干，取500 g 風(fēng)干后土樣氣流粉碎機(jī)粉碎后稱取0.5 g 土壤樣品，利用DNeasy Power Soil DNA Isolation Kit（Qiagen，Valencia，CA）試劑盒，按照說明書提取土壤DNA，最終洗脫體積為100 μL，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量和濃度后，用于土壤樣品中根結(jié)線蟲的熒光定量PCR檢測(cè)。

1.3 熒光定量PCR 分析

采用毛小芳等（2004）改良的貝爾曼漏斗法分離土壤中根結(jié)線蟲二齡幼蟲，并在顯微鏡下挑取1 000 條二齡幼蟲，提取線蟲基因組DNA，并將其梯度稀釋，制成1 000、100、10、1、0.1 條線蟲的標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)南方根結(jié)線蟲的ITS區(qū)（NCBI FJ534 516.1）ITS1部分保守序列，設(shè)計(jì)南方根結(jié)線蟲特異性引物MIITS7-F（5′-CCAATTTAATCGCAGTGGCTTG）和MIITS 127-R1（5′-CGACAGCCGTTTCACAACAATA）進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增。依據(jù)循環(huán)閾值（Cq 值）與根結(jié)線蟲二齡幼蟲的對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。土壤樣品中根結(jié)線蟲的種群密度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得。

qPCR 采用二步法，擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，樣品加熱到95 ℃保持1 min，立刻降至60 ℃保持5 s，然后每5 s 提高0.5 ℃遞增到95 ℃，建立熔解曲線。qPCR 反應(yīng)體系（20 μL）：10 μL 2× SG Fast qPCR Master Mix 預(yù)混液〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕，20 μmol·L引物MIITS7-F和MIITS127-R1 各1 μL，DNF Buffer 2 μL，土壤DNA 樣品1 μL，超純水補(bǔ)足20 μL，每個(gè)土壤DNA 樣品3 次重復(fù)。

1.4 防治黃瓜根結(jié)線蟲的田間試驗(yàn)方案

2020 年11 月至2021 年3 月在泰安市大汶口鎮(zhèn)北藤村多年連作種植的黃瓜棚，進(jìn)行黃瓜根結(jié)線蟲防治試驗(yàn)，每茬黃瓜根結(jié)線蟲病株率在90%以上。供試黃瓜品種為金禾1912，購(gòu)自山東金禾農(nóng)科種業(yè)有限公司。在黃瓜移栽前采用1.2 和1.3 的方法測(cè)定各小區(qū)土壤中根結(jié)線蟲的種群密度，并根據(jù)土壤中線蟲的種群密度將各小區(qū)分為線蟲輕度、中度和重度小區(qū)3 種類型，其中線蟲輕度小區(qū)8 個(gè)，中度小區(qū)8 個(gè)，重度小區(qū)4 個(gè)。小區(qū)面積13.5 m（9 m × 1.5 m），每小區(qū)定植60 株黃瓜。試驗(yàn)共設(shè)置4 個(gè)處理：越南伯克霍爾德氏菌菌劑（每穴9 g）、10%噻唑膦顆粒劑（每穴3 g）、復(fù)合處理（越南伯克霍爾德氏菌菌劑每穴9 g+10%噻唑膦顆粒劑每穴3 g）和空白對(duì)照，每處理設(shè)置5 個(gè)小區(qū)，2 個(gè)小區(qū)在線蟲輕度小區(qū)，2 個(gè)在線蟲中度小區(qū)，1 個(gè)在線蟲重度小區(qū)，同一類型小區(qū)內(nèi)各處理完全隨機(jī)排列。在黃瓜定植時(shí)，先將越南伯克霍爾德氏菌菌劑和10%噻唑膦顆粒劑施入定植穴內(nèi)，和定植穴內(nèi)土壤均勻混合后移栽黃瓜幼苗，定植后各小區(qū)管理操作一致，試驗(yàn)期間不施用防治根結(jié)線蟲的其他藥劑。

在黃瓜定植后60 d 每小區(qū)隨機(jī)挖取5 株黃瓜，參照Bridge 和Page（1980）的方法，對(duì)各處理根系樣品的根結(jié)進(jìn)行分級(jí)，并計(jì)算根結(jié)病情指數(shù)和防效（Wei et al.，2014），定植后105 d 將剩余黃瓜植株全部挖出，按前述方法進(jìn)行根系根結(jié)分級(jí)并計(jì)算根結(jié)病情指數(shù)和防效。在定植后60 d 和90 d 時(shí)分別對(duì)各小區(qū)進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定，每次測(cè)產(chǎn)連續(xù)測(cè)定3 d，然后將3 d 的產(chǎn)量之和作為1 次測(cè)產(chǎn)結(jié)果。定植后105 d 隨機(jī)選取5 株黃瓜，挖取植株根系，并用清水小心沖洗后晾干，記錄主根上分出的側(cè)根數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、使用SPSS statistics 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理樣品采用Duncan 新復(fù)極差法（＜0.05）分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小區(qū)土壤中根結(jié)線蟲的種群密度

依據(jù)Cq 值與根結(jié)線蟲二齡幼蟲的對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系，建立根結(jié)線蟲標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。并據(jù)此測(cè)定了田間試驗(yàn)中不同處理的25 個(gè)小區(qū)土壤中根結(jié)線蟲的種群密度，圖2 顯示熔解峰單一表明qPCR 產(chǎn)物特異性好，結(jié)果可以較好地反映土壤中南方根結(jié)線蟲的種群數(shù)量。本試驗(yàn)測(cè)定的小區(qū)中每1 kg土壤中的根結(jié)線蟲數(shù)量在15.8～408.4條之間，從25 個(gè)小區(qū)中選取20 個(gè)作為試驗(yàn)小區(qū)，選取每1 kg 土壤中的根結(jié)線蟲數(shù)量在0～50 條之間的小區(qū)定為線蟲輕度小區(qū)組，共8 個(gè)小區(qū)；將每1 kg 土壤中的根結(jié)線蟲數(shù)量在51～200 條之間的小區(qū)定為線蟲中度小區(qū)組，共8 個(gè)小區(qū)；將每1 kg 土壤中的根結(jié)線蟲數(shù)量在201～400 條之間的小區(qū)定為線蟲重度小區(qū)組，共4 個(gè)小區(qū)。

圖1 南方根結(jié)線蟲數(shù)量對(duì)數(shù)值與Cq 值間的擬合曲線

圖2 土壤基因組DNA 樣本qPCR 擴(kuò)增的熔解曲線

2.2 不同藥劑處理對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲病的防效

黃瓜定植后60 d 的測(cè)定結(jié)果表明（表1），在線蟲輕度、中度和重度小區(qū)中越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理的根結(jié)線蟲病情指數(shù)為1.06～5.20，對(duì)根結(jié)線蟲的平均防效達(dá)72.50%，與10%噻唑膦（平均防效68.47%）或單一越南伯克霍爾德氏菌B418 菌劑（平均防效63.29%）施用相比，防效有一定程度的提升，但差異不顯著（以單獨(dú)計(jì)算的線蟲輕度、中度和重度小區(qū)的防效作為重復(fù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，下同）。

黃瓜定植后105 d 的測(cè)定結(jié)果表明（表1），在線蟲輕度、中度和重度小區(qū)中越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理的根結(jié)線蟲病情指數(shù)為3.87～13.84，對(duì)根結(jié)線蟲的平均防效達(dá)63.99%，與10%噻唑膦（平均防效58.34%）或單一越南伯克霍爾德氏菌B418 菌劑（平均防效57.08%）施用相比，具有顯著的增效作用（＜0.05）。

2.3 不同藥劑處理對(duì)黃瓜產(chǎn)量的影響

不同藥劑處理對(duì)黃瓜產(chǎn)量的影響如表2 所示，根據(jù)定植前土壤線蟲種群密度劃分的輕度小區(qū)、中度小區(qū)和重度小區(qū)之間黃瓜產(chǎn)量差異非常大。黃瓜定植后60 d 時(shí)測(cè)產(chǎn)，線蟲重度小區(qū)對(duì)照產(chǎn)量為3.20 kg，低于3 種類型小區(qū)對(duì)照的平均產(chǎn)量（3.58 kg），而且重度小區(qū)的對(duì)照病情指數(shù)（15.42）也是3 種類型小區(qū)中最高的（表1），說明從定植后60 d開始根結(jié)線蟲已經(jīng)對(duì)黃瓜產(chǎn)量產(chǎn)生影響。至定植后90 d 時(shí)，線蟲重度小區(qū)對(duì)照的產(chǎn)量?jī)H為0.65 kg，說明根結(jié)線蟲已嚴(yán)重影響產(chǎn)量。越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理則可以更好地降低根結(jié)線蟲對(duì)黃瓜產(chǎn)量造成的損失，在定植后60 d 時(shí)，越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理與對(duì)照相比增產(chǎn)48.10%～101.56%，在定植后90 d 時(shí)增產(chǎn)達(dá)95.65%～392.31%，其增產(chǎn)效果明顯優(yōu)于單一越南伯克霍爾德氏菌B418 或單一噻唑膦處理；在定植后60、90 d 時(shí)增產(chǎn)率分別較單一噻唑膦處理提高8.86～71.87 百分點(diǎn)和21.74～230.77 百分點(diǎn)，在線蟲重度小區(qū)增產(chǎn)尤為明顯。說明越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理具有協(xié)同增效作用，在防治根結(jié)線蟲病的同時(shí)能有效減少線蟲危害造成的黃瓜產(chǎn)量損失。

表1 不同藥劑處理對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲病情指數(shù)和防效的影響

表2 不同藥劑處理對(duì)黃瓜產(chǎn)量的影響

2.4 不同藥劑處理對(duì)黃瓜根系的影響

在定植后105 d 時(shí)從不同處理組中隨機(jī)挑選5株黃瓜，如圖3 所示，越南伯克霍爾德氏菌B418配合噻唑膦處理的根系側(cè)根明顯增多。其中，對(duì)照平均側(cè)根數(shù)5.1 條·根，但根結(jié)數(shù)較多；噻唑膦處理雖然根結(jié)數(shù)比對(duì)照少但平均側(cè)根數(shù)僅為4.2 條·根；越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理的平均側(cè)根數(shù)則為10.4 條·根，同時(shí)根結(jié)數(shù)也比對(duì)照少；單一越南伯克霍爾德氏菌B418 處理平均側(cè)根數(shù)為6.2 條·根，根結(jié)數(shù)介于對(duì)照和越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理組之間。說明雖然噻唑膦處理可以有效防治根結(jié)線蟲，但同時(shí)也會(huì)影響植株的根系生長(zhǎng)發(fā)育，從而影響黃瓜產(chǎn)量，而越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理則可以改善單一噻唑膦處理對(duì)植株生長(zhǎng)的這種負(fù)面影響，有助于黃瓜產(chǎn)量的提高。

圖3 定植后105 d 不同處理對(duì)黃瓜根系的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)針對(duì)土壤中線蟲種群密度分布不均勻的問題，改進(jìn)了小區(qū)試驗(yàn)的隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，首先采用qPCR 測(cè)定了每個(gè)小區(qū)土壤中根結(jié)線蟲數(shù)量，并按土壤中根結(jié)線蟲的種群密度將小區(qū)劃分為線蟲輕度、中度、重度3 個(gè)不同等級(jí)；然后，再將不同處理隨機(jī)排列到不同等級(jí)小區(qū)中，病情指數(shù)和防效在同等級(jí)小區(qū)內(nèi)測(cè)定，克服了直接隨機(jī)排列可能出現(xiàn)的不同處理的小區(qū)線蟲種群密度差異大對(duì)結(jié)果造成的不利影響。以對(duì)照為例，從表1 的結(jié)果可以看出，2 個(gè)線蟲輕度小區(qū)黃瓜定植后105 d 時(shí)對(duì)照的病情指數(shù)為12.05 和25.28，而線蟲重度小區(qū)則為38.24，差距較大。這也說明即使在同一蔬菜大棚中，根結(jié)線蟲的發(fā)生也常不均一，呈島狀分布。所以，按土壤中根結(jié)線蟲的種群密度將小區(qū)劃分成不同等級(jí)，同等級(jí)小區(qū)之間進(jìn)行比較結(jié)果才更準(zhǔn)確。此外，紀(jì)春濤等（2010）發(fā)現(xiàn)化學(xué)殺線劑雖然可以減少線蟲對(duì)植株的為害，但也會(huì)對(duì)植株根系發(fā)育造成影響，從圖3 可以看出，噻唑膦處理后植株側(cè)根數(shù)量明顯比對(duì)照及使用生防菌劑的處理少，因此，植株?duì)I養(yǎng)吸收也會(huì)相應(yīng)減弱，表2 的產(chǎn)量結(jié)果也進(jìn)一步印證了上述結(jié)果，在黃瓜定植后90 d 時(shí)噻唑膦處理組產(chǎn)量明顯低于越南伯克霍爾德氏菌B418配合噻唑膦處理組，在線蟲重度小區(qū)上述趨勢(shì)尤為明顯。

綜上所述，采用越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦防治黃瓜根結(jié)線蟲病，與單一噻唑膦處理或單一越南伯克霍爾德氏菌B418 處理相比，在不同線蟲種群密度小區(qū)中均顯示出更佳的防病和增產(chǎn)效果，具有協(xié)同增效作用，不但增強(qiáng)了對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲病的防治效果，還促進(jìn)了植株根系發(fā)育，提高了黃瓜產(chǎn)量。