抑制食源性致病菌脂肽的分離鑒定及生物學(xué)特性分析

丁飛鴻，耿云龍，樊士德，彭雙雙，鄒曦，趙宜峰，陳騰，高兆建*

1(徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州，221018)2(長江桂柳食品睢寧有限公司，江蘇 徐州，221000)

芽孢桿菌是一類能夠耐受極端惡劣環(huán)境的革蘭氏陽性細菌，能夠產(chǎn)生20多種不同類型的抗菌化合物[1]，根據(jù)抗菌物質(zhì)生物合成機制可分為核糖體合成的細菌素和非核糖體合成的抗菌肽[2]。細菌素是細菌產(chǎn)生的抗菌多肽，不同來源的細菌素其抑菌譜不同，迄今已經(jīng)分離鑒定了一些細菌素，如枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的枯草菌素和枯草桿菌素A[3]，凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生的凝固素[4]；蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的Bacthuricin F4和系列蘇云金素[5]，地衣芽孢桿菌P40和蠟樣芽胞桿菌ATCC 4579產(chǎn)生的類細菌素物質(zhì)[6]。雖然已經(jīng)鑒定出多種細菌素，且由乳酸乳球菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素和由嗜酸片球菌產(chǎn)生的片球菌素PA-1已在食品工業(yè)中商業(yè)化使用，但其在抗菌譜及穩(wěn)定性方面還存在局限，故開發(fā)芽孢桿菌中的另一類抗菌物質(zhì)——脂肽具有現(xiàn)實應(yīng)用意義。脂肽類化合物包括芬芥素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)、表面活性素家族，其主要由1個肽環(huán)和脂肪酸鏈組成，是一類具有親水親油特性的化合物[7]。因其具有廣泛的生物活性如廣譜抗細菌、抗病毒、抗霉菌、抗癌和免疫抑制等[8]，并具有影響細胞膜通透性并最終導(dǎo)致細胞破裂菌體死亡的特定機制，在生物防治、環(huán)境保護、醫(yī)藥治療和食品健康等方面具有潛在的利用價值，因此受到越來越多的關(guān)注。

表面活性素主要是芽孢桿菌屬細菌所產(chǎn)生的一類重要環(huán)狀脂肽[9]，包含多種同系物和同分異構(gòu)體，如表面活性素(surfactin)、普米拉西丁(pumilacidin)和地衣菌素(lichenysin)，它們因其脂肪酸鏈長度和分支變化以及肽環(huán)中的氨基酸不同而有差異。表面活性素除了具有較強的抗細菌功能外，還具有溶血、抗凝血和抗腫瘤等活性，其活性與它們與生物大分子的相互作用有關(guān)[10]。雖然國內(nèi)外對表面活性素的研究較多，但主要圍繞表面活性和植物病蟲害防治方面。近年來脂肽在食品防腐領(lǐng)域也有一些報道，但存在抗菌譜窄、穩(wěn)定性差、產(chǎn)量低等各種缺陷，限制了脂肽在食品防腐領(lǐng)域的應(yīng)用。脂肽在芽孢桿菌屬細菌中廣泛存在，不同的芽孢桿菌所產(chǎn)生的脂肽其結(jié)構(gòu)和抑菌特性往往不同，故深入挖掘產(chǎn)脂肽菌種資源，尋找新的脂肽并研究其特性對開發(fā)天然安全健康的食品防腐劑具有重要意義。

在本研究中，我們從中國傳統(tǒng)香腸中分離出1種產(chǎn)脂肽的菌株XZK-18，對菌株進行分類鑒定，從其發(fā)酵液中分離純化抗菌脂肽，并鑒定脂肽類別，研究脂肽的抑菌機理、理化特性及抗菌譜，為開發(fā)新型天然防腐劑、保障消費者的飲食健康奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品、培養(yǎng)基與儀器

1.1.1 實驗樣品

分離篩選產(chǎn)生抗菌脂肽菌株的樣品取自江蘇省睢寧縣農(nóng)村傳統(tǒng)方法自制香腸。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，g/L)：NaCl 10，酵母提取物5，胰蛋白胨10，調(diào)pH至7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖20，蛋白胨10，NH4NO32，KH2PO43，Na2HPO42，MgSO40.2，酵母膏0.2，CaCl20.000 7，MnSO40.001，pH自然。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TC-C18高效液相色譜半制備柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、1100 series高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；3K30型臺式冷凍離心機，德國Sigma公司；AKTA EXPLORER蛋白純化系統(tǒng)，美國GE Healthcare公司；Nicolet 380型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；SHB-Ⅲ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；GeneAmp 9700 PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)抗菌脂肽芽孢桿菌的篩選

稱取香腸20 g，切成1 cm長，轉(zhuǎn)移至裝有180 mL無菌水的勻漿機中，經(jīng)充分勻漿后靜置10 min，吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的勻漿液100 μL涂布于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2～4 d，氯仿熏蒸法篩選拮抗菌株[11]。瓊脂孔擴散法[11]檢測發(fā)酵液抑菌活性，挑選1株抑菌活性較強、抑菌譜廣的菌株深入研究。

1.2.2 菌株形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

篩選到的菌株在牛肉膏蛋白胨平板上劃線，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察單菌落的顏色、形狀、光滑度等指標(biāo)，并進行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征和產(chǎn)芽孢情況。

1.2.2.2 16S rRNA序列分析鑒定

16S rRNA序列擴增采用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3′。PCR擴增反應(yīng)體系為25 μL，包含有1 μL DNA模板，引物(10 μmol/L)各1 μL，2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，0.3 μL Tap DNA polymerase和17.2 μL ddH2O。擴增條件：95 ℃下3 min，95 ℃下30 s，55 ℃下30 s，72 ℃下1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR的產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測。PCR產(chǎn)物測序后，將16 S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進行BLAST比對分析。選取相相似度高的相關(guān)菌株序列，用MEGA 6.0軟件進行多序列匹配分析并采用Neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并進行1 000次的Bootstrap檢驗。

1.2.3 抗菌脂肽的發(fā)酵

取甘油保藏的菌株用接種環(huán)挑取1環(huán)進行平板劃線，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，挑取平板上的單菌落至LB瓊脂斜面，靜置培養(yǎng)24 h。挑取斜面菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，即為種子液。按照2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃下180 r/min振蕩發(fā)酵48 h。每隔2～4 h，取3 mL發(fā)酵液檢測OD600吸光值以及所產(chǎn)脂肽對蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，以抑菌圈直徑大小表示抑菌活性高低。

1.2.4 抗菌脂肽的分離純化

1.2.4.1 抗菌脂肽粗提

將上述發(fā)酵48 h的發(fā)酵液于-4 ℃的環(huán)境下8 000 r/min離心15 min；取上清液用6 mol/L的HCl溶液將上清液調(diào)至pH 2.0，靜置過夜；8 000 r/min離心，取沉淀，用甲醇抽提3次，8 000 r/min 離心10 min；上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器50 ℃減壓濃縮，得到脂肽粗提物，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 抗菌脂肽Sephadex LH-20層析

Sephadex LH-20柱層析純化脂肽參照文獻[12]方法并稍微改動。凝膠干粉用去離子水充分溶脹后，利用重力沉降原理裝填入15 mm×800 mm 層析柱中，50%甲醇充分平衡；脂肽粗提物溶解于50%甲醇中，并通過0.45 μm過濾器過濾后上樣于Sephadex LH-20色譜柱，洗脫緩沖液為50%甲醇，流速為1 mL/min，每管收集3 mL，瓊脂孔擴散法分析檢測每個洗脫峰的抑菌活性。多個循環(huán)洗脫后，將活性組分混合并用50 ℃的吹氮儀干燥。

瓊脂孔擴散法測定抑菌活性具體為在LB瓊脂平板上均勻涂布150 μL過夜培養(yǎng)好的濃度為1×107CFU/mL的指示菌菌液，表面晾干后以6 mm直徑的打孔器平板上打孔，取相同量的收集液注入孔中，37 ℃培養(yǎng)12～18 h后查看抑菌圈情況并測定抑菌圈直徑，以該直徑表示抑菌活性大小。

1.2.4.3 抗菌脂肽半制備反向高效液相色譜(reverse-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)法分離純化

將經(jīng)Sephadex LH-20分離獲得的活性組分進一步使用RP-HPLC法純化，具體參照文獻[13]方法。流動相A：0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)水溶液，流動相B：0.1% TFA乙腈。洗脫速度：2 mL/min，檢測波長220 nm。梯度洗脫條件：0～60 min內(nèi)溶劑B的線性梯度從10%增加到90%。濾紙片法檢測各洗脫峰抑菌活性。

1.2.5 抗菌脂肽的鑒定

1.2.5.1 抗菌脂肽薄層色譜分析

經(jīng)酸沉淀并萃取得到的粗提物樣品進行薄層層析(thin-layer chromatography,TLC)法分析。具體參照文獻[14]并稍作改動。溶解在甲醇中的樣品在硅膠薄層色譜板上點樣，以體積比65∶25∶4的氯仿、甲醇和水的混合溶液為流動相展開色譜板。展開結(jié)束后將色譜板放在封閉的層析缸中碘蒸汽熏蒸，觀察層析板上是否有黃色斑點出現(xiàn)以確定樣品分子中是否有脂質(zhì)存在；另一塊薄層色譜板干燥后，噴灑茚三酮溶液，在110 ℃下烘烤30 min，觀察是否出現(xiàn)粉紅色或紅色斑點，確定是否有肽的存在。測定所顯示斑點的遷移率(retention factor，Rf)，并與文獻報道的特征Rf值比較。

TLC-生物自顯影參照文獻方法[14]。展開后的層析板晾干后置于空的滅過菌的培養(yǎng)皿中，倒入60 ℃左右的LB瓊脂培養(yǎng)基，充分凝固后，分別涂布150 μL濃度為1.0×108CFU/mL的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液，表面晾干后置于37 ℃培養(yǎng)箱，12～24 h觀察抑菌圈并測定抑菌圈Rf值。檢測對霉菌的抑制作用，將層析板置于培養(yǎng)皿，覆蓋熔化好的PDA培養(yǎng)基，涂布150 μL濃度為1.0×106個/mL的黑曲霉分生孢子懸液，表面晾干后28 ℃孵育2～4 d，檢測培養(yǎng)皿中是否有抑菌圈出現(xiàn)。

1.2.5.2 抗菌脂肽傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)掃描

利用FT-IR推斷經(jīng)過純化的抑菌活性成分存在的化學(xué)鍵和官能團，初步鑒定抑菌成分。光譜數(shù)據(jù)采集范圍為378～4 000 cm-1，光譜分辨率為4.0 cm-1，收集的數(shù)據(jù)是整個范圍內(nèi)50次掃描的平均值。

1.2.6 掃描電鏡分析細菌形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

掃描電鏡觀察經(jīng)過脂肽處理后的菌體顯微結(jié)構(gòu)變化，探索脂肽抑菌機理。參照文獻方法[15]制備菌體樣品，將大腸桿菌37 ℃ LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按照10%的接種量接種至新的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.6，取2 mL至離心管，加入純化后的脂肽，37 ℃ 120 r/min搖床振蕩2 h，立即冰浴2 min，4 ℃ 5 000 r/min離心5 min，去上清液，加入100 mmol/L pH 8.0的磷酸緩沖液，吹打懸浮，再次離心，倒掉上清液，再次重復(fù)加緩沖液，再離心。倒掉上清液，加入2.5%體積分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液，4 ℃固定過夜。使用75%～100%的乙醇逐級脫水，真空冷凍干燥，再將樣品在真空鍍膜機內(nèi)把金噴鍍到樣品表面，掃描電鏡進行觀察。未經(jīng)過脂肽處理的大腸桿菌作為對照。

1.2.7 抗菌脂肽抑菌譜測定

采用瓊脂擴散法測定脂肽抑菌譜。選擇5株革蘭氏陽性細菌、5株革蘭氏陰性細菌、3株真菌作為指示菌，檢測脂肽對這些菌株的抑菌性能。細菌使用LB瓊脂培養(yǎng)基，真菌使用PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2～4 d，游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.2.8 抗菌脂肽穩(wěn)定性

1.2.8.1 熱穩(wěn)定性

將純化后的脂肽分別于70、80、90、100、110、120 ℃ 下各處理30 min，以蠟樣芽胞桿菌為指示菌瓊脂孔擴散法檢測抑菌活性。

1.2.8.2 酸堿穩(wěn)定性

將純化的脂肽用1.2 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液分別調(diào)pH至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，4 ℃處理1～10 d，再調(diào)pH至7.0，以蠟樣芽胞桿菌為指示菌瓊脂孔擴散法檢測抑菌活性。

1.2.9 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進行誤差分析。脂肽抑菌活性測定中，每個處理設(shè)置3個平行樣，計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用t-檢驗顯著性分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肽菌株篩選鑒定

篩選得到1株抑菌活性較強的菌株XZK-18，其發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌抑菌活性如圖1所示，對2種菌株均產(chǎn)生了強烈的抑制作用。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后菌落呈圓形、邊緣整齊、乳白色、表面不光滑有褶皺、不透明。油鏡下觀察，革蘭氏陽性，菌體形態(tài)呈桿狀，兩短鈍圓，芽孢呈橢圓形中生。生理生化試驗顯示，明膠液化、接觸酶試驗、V.P試驗、檸檬酸鹽利用為陽性，甲基紅試驗、硝酸鹽還原、吲哚試驗、淀粉水解、H2S試驗為陰性，能利用阿拉伯糖、D-山梨醇、纖維二塘、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖，不能利用α-乳糖、D-木糖、D-甘露糖，可在7%～10%的含鹽培養(yǎng)基中正常生長。根據(jù)典型的生理生化特征初步確定菌株XZK-18為短小芽孢桿菌。

CK-磷酸緩沖溶液為空白對照a-金黃色葡萄球菌；b-蠟樣芽胞桿菌圖1 菌株XZK-18發(fā)酵液的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of the fermentation broth of strain XZK-18

菌株16S rRNA擴增到大小約1 500 bp的PCR特征性條帶，測序結(jié)果在GenBank中與己知序列進行BLAST比對，與短小芽孢桿菌SAFR-032的16 S rRNA一致性為100%。以菌株XZK-18的16 S rRNA序列與相近序列的比對，通過MEGA 6.0軟件軟件進行多序列匹配分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，菌株XZK-18與BacilluspumilusSAFR-032在同一個分支上(圖2)，綜合形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化試驗結(jié)果，鑒定XZK-18為短小芽孢桿菌。芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，近年來文獻報道了大量產(chǎn)脂肽的不同類型的芽孢桿菌屬菌株如解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[16]等，但大多脂肽研究主要圍繞其表面活性劑特性或者在生物防治中的抗真菌特性，本研究的脂肽前期篩選中使用了大量細菌指示菌株，主要目的是篩選應(yīng)用于食品防腐的抗細菌脂肽產(chǎn)生菌株，篩選到的短小芽孢桿菌XZK-18是1株有應(yīng)用潛力的廣譜細菌拮抗菌株。

圖2 菌株XZK-18 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain XZK-18 16S rRNA

2.2 抗菌脂肽發(fā)酵制備

為了研究抗菌脂肽產(chǎn)量變化與細菌生長的關(guān)系，本實驗連續(xù)48 h測定菌株XZK-18 OD600值與其發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌的抑菌圈直徑，結(jié)果見圖3。培養(yǎng)至8 h后，發(fā)酵上清液開始對2種指示菌表現(xiàn)出抑菌活性，在8～24 h，隨著發(fā)酵時間延長，抑菌活性增強。培養(yǎng)24 h后，抑菌活性達到最大，并隨著發(fā)酵時間延長抑菌活性保持不變，直到48 h。菌株XZK-18所產(chǎn)脂肽對蠟狀芽孢桿菌抑菌活性相對金黃色葡萄球菌要高。對照細菌生長曲線，脂肽合成主要在對數(shù)期的末期大量合成，并在穩(wěn)定期前期達到峰值，穩(wěn)定期脂肽抑菌活性基本無變化，整體看出脂肽合成同菌體的生長呈現(xiàn)部分相關(guān)性，這與GONZLEZ-JARAMILLO等[17]報道的脂肽合成曲線相類似；而BALAN等[18]研究的AneurinibacillusaneurinilyticusSBP-11脂肽同菌體生長曲線完全吻合，呈現(xiàn)典型的初級代謝產(chǎn)物合成特性。菌株XZK-18脂肽合成曲線看出，在穩(wěn)定期后期，脂肽活性沒有降低，而肽類抑菌物質(zhì)細菌素往往后期活性會顯著降低，間接這證實菌株XZK-18所產(chǎn)抑菌物質(zhì)不是細菌素。

圖3 短小芽孢桿菌XZK-18抗菌脂肽合成和菌體生長曲線Fig.3 Antimicrobial substance synthesis and growth curve of Bacillus pumilus XZK-18

2.3 抗菌脂肽的薄層層析及生物自顯影

為初步確定抗菌物質(zhì)的種類，用碘蒸汽和茚三酮顯色對抗菌脂肽TLC分析，結(jié)果如圖4所示，碘蒸氣熏蒸后的層析板出現(xiàn)多個黃色斑點，其中3個斑點較為明顯，對應(yīng)Rf值分別為0.78、0.50和0.11(見圖4-a)，其中Rf值得為0.78的斑點顯色最為強烈，說明對應(yīng)斑點分子中含有脂質(zhì)[19]；茚三酮噴灑后在對應(yīng)相同的位置也出現(xiàn)了3個明顯的粉紅色斑點，斑點強弱程度同碘蒸氣熏蒸板斑點相一致，證明分子中含有氨基酸的存在。由以上可以判斷樣品中至少含有3種類型的化合物且分子由肽和脂質(zhì)組成，推測屬于脂肽類。根據(jù)文獻報道[20]，Rf值為0.5和0.78的脂肽屬于表面活性素，這分別與SRIRAM等[21]報道的BacilluscereusNK1脂肽表面活性素(surfactant)(0.52)相接近，表面活性素是芽孢桿菌屬一種典型的脂肽類，具有較大的抗細菌活性；對比文獻[22]Rf值0.11的脂肽屬于伊枯草菌素類，含量較低。

分別以革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌為指示菌通過TLC-生物自顯影分析建立脂肽與其抑菌活性的直接關(guān)系，進一步確定脂肽化合物的分子類型。結(jié)果表明，所有斑點對霉菌均沒有抑制作用，但Rf值0.78對應(yīng)的位點對兩種細菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，且抑制活性較強(如圖4-c～圖4-d)，這同文獻報道的芬芥素和伊枯草菌素脂肽對應(yīng)的抑菌帶(Rffen=0.1～0.2，Rfitu=0.3～0.4)不同[14]，但與SRIRAM等[21]報道的表面活性素脂肽(Rfsrf=0.7)對大腸桿菌的抑菌情況相類似。Rf值為0.11的，沒有檢測到對真菌指示菌的抑菌活性，這有可能是因為菌體合成量偏低所至，從層析板所顯示的較弱的斑點也可以證實。綜上可知，發(fā)酵液的抑菌活性可能主要源于芽孢桿菌合成的表面活性素。

a-碘熏蒸；b-茚三酮顯色；c-大腸桿菌；d-金黃色葡萄球圖4 短小芽孢桿菌XZK-18脂肽TLC和TLC-生物自顯影分析Fig.4 TLC and TLC-bioautographic analysis of lipopeptides from Bacillus pumilus XZK-18

2.4 抗菌脂肽的分離純化

經(jīng)酸沉淀甲醇萃取后的樣品進一步葡聚糖凝膠Sephadex LH-20層析，洗脫曲線如圖5-a所示，共得到4個洗脫峰，分別命名為組分F1、F2、F3、F4。對各個峰的收集液抑菌活性檢測(圖5-b)，僅檢測到吸收峰F2處收集液有明顯抑菌活性，因此判斷洗脫峰F2為活性峰，收集活性洗脫液，進一步通過RT-HPLC純化。

a-Sephadex LH-20層析；b-抑菌活性檢測圖5 短小芽孢桿菌XZK-18抗菌脂肽Sephadex LH-20層析Fig.5 Sephadex LH-20 chromatography of Bacillus pumilus XZK-18 antibacterial substance

經(jīng)Sephadex LH-20純化的得到的洗脫峰F2活性樣品再通過RP-HPLC層析純化，得到的洗脫曲線如圖6-a所示，洗脫出9個比較大的吸收峰，對每個洗脫峰檢測抑菌活性，如圖6-b所示，P4洗脫峰有顯著的抑菌活性，P6洗脫峰僅顯示略微的抑菌圈。進一步證實短小芽孢桿菌XZK-18菌株可以產(chǎn)生不止1種脂肽，這與文獻報道的脂肽通常以多種亞型或同系物的形式存在相一致[9]，特別是報道的一些芽孢桿菌屬細菌更為普遍，如解淀粉芽孢桿菌SR1所產(chǎn)抗菌脂肽為表面活性素，同時含有伊枯草菌素和芬芥素[18]；B.amyloliquefaciensPGPBacCA1在核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)和茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)存在的情況下同時產(chǎn)生不同的脂肽同系物表面活性素、伊枯菌素和芬芥素[23]；Bacillussp.SL-6其發(fā)酵液中檢測到4種芬芥素A和2種芬芥素B。整體顯示，本研究脂肽分離純化中先通過Sephadex LH-20初步純化，去除對后續(xù)純化影響較大的色素及大分子等雜質(zhì)成分，再使用RP-HPLC將物質(zhì)按照極性強弱分開，得到活性組分P4，分離效果好，可以將絕大部分雜質(zhì)同脂肽分離，本研究所用分離方法可為脂肽的純化提供借鑒。

a-RP-HPLC洗脫曲線；b-抑菌活性檢測圖6 短小芽孢桿菌XZK-18抗菌脂肽RP-HPLC純化Fig.6 Purification of antibacterial substance of Bacillus pumilus XZK-18 by RP-HPLC

2.5 脂肽類抑菌成分的FT-IR分析

菌株XZK-18所產(chǎn)脂肽FT-IR分析如圖7所示，在3 432.74、3 387.36 cm-1的吸收峰是由N—H拉伸模式產(chǎn)生[15]，在1 646.18 cm-1處強烈的吸收譜帶為CO—N鍵的拉伸模式產(chǎn)生，而在1 541.26 cm-1的吸收峰是由于N—H鍵結(jié)合C—N鍵的變形模式產(chǎn)生，由此確定抗菌物質(zhì)分子中存在多肽結(jié)構(gòu)。在2 957.54～2 861.34 cm-1和1 402.30～1 205.22 cm-1處的吸收峰是由于的C—H拉伸模式產(chǎn)生，由此確定分子中存在脂肪酸鏈。而且1 724.17-1處的譜帶是由于內(nèi)酯羰基吸收而形成，說明分子中含有環(huán)肽結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果有力表明，該抗菌物質(zhì)含有有脂肪烴和肽片段。經(jīng)分離純化的脂肽FT-IR與文獻報道的環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)等芽孢桿菌屬細菌產(chǎn)生的表面活性素分子的特征有明顯的相似性[16]，由此進一步證實短小芽孢桿菌XZK-18所產(chǎn)抗菌脂肽主要為表面活性素。

圖7 短小芽孢桿菌XZK-18抗菌脂肽FT-IR掃描Fig.7 FT-IR of antimicrobial substance of Bacillus pumilus XZK-18

2.6 大腸桿菌經(jīng)脂肽處理后的掃描電鏡

未經(jīng)脂肽處理和經(jīng)脂肽處理后的大腸桿菌掃描電鏡如圖8所示，未經(jīng)處理的大腸桿菌具有完整的生物膜結(jié)構(gòu)，菌體飽滿、表面光滑(圖8-a)，而用純化脂肽處理2 h后的大腸桿菌與未處理的對照菌株比較發(fā)現(xiàn)，脂肽致使菌體表面形成孔洞，其周圍細胞膜向內(nèi)塌陷，而且孔多分布在菌體頭部(圖8-b)，部分菌體收縮變形，表面不平整，這表明脂肽對菌體細胞壁細胞膜有破壞作用。推測，菌株XZK-18所產(chǎn)表面活性素對大腸桿菌等敏感細胞的殺菌或抑菌作用，是因其致使菌體細胞膜穿孔，細胞內(nèi)容物向外滲漏，致使菌體死亡，這是其抑菌作用的主要作用機制，這與文獻報道的脂肽家族中的表面活性素殺菌機制相吻合[18]，有力證實了短小芽孢桿菌XZK-18所產(chǎn)脂肽主要為表面活性素。SONG等[24]報道的解淀粉芽孢桿菌R3所產(chǎn)表面活性素對大腸桿菌的細胞膜也有類似的破壞作用。細胞膜是細菌自產(chǎn)的胞外聚合物，可以使菌體更好地適應(yīng)外界環(huán)境，增加其自身毒性和增強對外界抗生素或病毒的抗性。在食品工業(yè)中，食源性致病菌或腐敗菌容易附著在設(shè)備表面形成生物膜，特別是在難以直接清洗接觸到的設(shè)備部件位置，難以徹底清洗，容易引起交叉污染，帶來嚴(yán)重的食品安全問題。脂肽通過生物膜的破壞作用殺滅病原菌，這在食品防腐及醫(yī)藥應(yīng)用中具有重要應(yīng)用前途。

a-未經(jīng)脂肽處理；b-經(jīng)脂肽處理圖8 大腸桿菌經(jīng)脂肽處理前后的掃描電鏡Fig.8 Scanning electron microscopes of untreated and treated with lipopeptide

2.7 脂肽抗菌譜檢測

在本研究中，選用了13株指示菌，其中5株革蘭氏陰性菌，5株革蘭氏陽性菌，3株真菌。其中大多數(shù)為食源性致病菌或腐敗菌，如金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、傷寒沙門氏菌、副溶血性弧菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌等。瓊脂孔擴散法檢測抑菌活性顯示，孔周圍出現(xiàn)了大小不等的顯著的抑菌圈，具體大小如表1所示。菌株XZK-18所產(chǎn)脂肽對所有細菌均具有抑菌活性，其中對革蘭氏陽性菌的抑菌效果最為明顯，尤其是金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌抑菌活性最強，其抑菌圈直徑達到22 mm以上。對革蘭氏陰性菌也有一定的抑菌效果，抑菌圈直徑在13～21 mm。對比脂肽對革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑菌活性，存在顯著性差異(P<0.05)。脂肽對白色念珠菌、畢赤酵母、黑曲霉等真菌的抑菌活性同空白對照(磷酸緩沖溶液)沒有顯著性差異(P>0.05)，說明無抑菌活性。推測脂肽對不同類型的微生物的抑菌活性與細胞壁或細胞膜的結(jié)構(gòu)構(gòu)成有重要關(guān)系。脂肽對細菌的抑制作用多有報道，如韋露等[25]研究報道的1株短小芽孢桿菌B1對溶藻弧菌、殺鮭氣單胞菌、哈氏弧菌等水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌有抑制作用，但同樣對例如金黃色葡萄球菌的食源性病原性無抑制作用。而本研究脂肽在抑制食源性致病菌腐敗菌方面具有顯著優(yōu)勢，有潛力作為生物防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)中，減少化學(xué)合成防腐劑的使用，延長食品保貨架期。

表1 短小芽孢桿菌XZK-18脂肽抑菌譜Table 1 Antimicrobial spectrum of Bacillus pumilus XZK-18 lipopeptide

2.8 抗菌脂肽穩(wěn)定性分析

2.8.1 抗菌脂肽熱穩(wěn)定特性

脂肽熱穩(wěn)定性如圖9所示，在70～100 ℃保溫30 min脂肽抑菌抑菌活性基本無變化，差異顯著性分析表明，70～100 ℃處理后的脂肽抑菌圈同磷酸緩沖液空白對照沒有顯著性差異(P>0.05)，說明70～100 ℃脂肽耐熱性較好。110 ℃ 30 min后抑菌活性略微減少，但加熱至120 ℃ 30 min后，抑菌活性明顯下降，但仍能看出顯著的抑菌活性?？梢娭脑?10 ℃以下耐熱性較好。不同來源的脂肽其熱穩(wěn)定性區(qū)別較大，如BEN AYED等[26]報道的莫海威芽孢桿菌(BacillusmojavensisA21)脂肽也具有良好的熱穩(wěn)定性，但其在90、100 ℃保溫15 min抑菌活性就開始出現(xiàn)下降。脂肽良好的耐熱性使其應(yīng)用范圍更為廣泛，可以在更為極端的熱環(huán)境下使用。食品工業(yè)防腐中，使用單一的抗菌物質(zhì)很難確保完全的防腐效果，故通常將1種抗菌物質(zhì)和其他幾種抗菌化合物或抗菌技術(shù)聯(lián)合使用，例如適當(dāng)?shù)臒嵯?、脈沖電場、射線消毒等，本研究脂肽完全能夠承受食品加工過程中的巴氏殺菌等熱處理過程。

圖9 不同溫度對抗菌脂肽抑菌活性的影響Fig.9 Effects of different temperatures on antibacterial activity of antimicrobial lipopeptid

2.8.2 抗菌脂肽酸堿穩(wěn)定性

在惡劣的貯存環(huán)境下具備良好的穩(wěn)定性是脂肽開發(fā)應(yīng)用的重要前提。脂肽酸堿穩(wěn)定性情況如圖10所示，抗菌脂肽在pH 5～9環(huán)境下保存1～10 d相對抑菌活性都處在85%以上，具有較穩(wěn)定的抑菌活性；而pH在3.0和11.0時，隨著貯存時間延長，抑菌活性均出現(xiàn)降低，但貯存10 d抑菌活性仍然在70%以上。因此脂肽具有非常好的酸堿穩(wěn)定性，與李旭等[27]報道的枯草芽孢桿菌抗菌脂肽酸堿穩(wěn)定性類似。但不同來源的脂肽酸堿抑菌穩(wěn)定性區(qū)別較大，陸雅琴等[28]報道的芽孢桿菌P6抗菌脂肽在pH>9.0時抑菌活性喪失，但李紅曉等[29]研究的解淀粉芽孢桿菌MH71脂肽在pH 5～11的環(huán)境下抑菌活性較強，pH<4時穩(wěn)定性顯著下降。整體看，脂肽在寬泛的pH范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，有潛力在不同酸堿度的食品中使用。

圖10 不同pH對抗菌脂肽抑菌活性的影響Fig.10 Effect of different pH on antibacterial activity of antimicrobial lipopeptid

3 結(jié)論

本研究從徐州市睢寧縣農(nóng)村自制香腸中分離到1株對多種食源性病原菌有抑菌活性的短小芽孢桿菌XZK-18。菌株發(fā)酵液中提取的抗菌物質(zhì)經(jīng)TLC及TLC-生物自顯影分析確定為脂肽類混合物，包括表面活性素和伊枯草菌素。分離純化的脂肽不僅可以抑制致病性的革蘭氏陽性菌如蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和單核增生李斯特菌，還對容易引起人類重大疾病的革蘭氏陰性菌如銅綠假單胞菌、大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、副溶血性弧菌和福氏志賀氏菌也有抑制作用，故該脂肽有潛力開發(fā)為食品防腐劑，抑制食源性致病菌；同時可以在醫(yī)藥領(lǐng)域中使用。掃描電鏡顯示脂肽通過破壞細胞膜完整性、使細胞壁穿孔、細胞膜通透性增強殺滅大腸桿菌。脂肽良好的熱穩(wěn)定性、酸堿耐受性和廣譜殺菌活性表明其在多種工業(yè)領(lǐng)域如環(huán)境生物修復(fù)、制藥、生物防治、化妝品、飼料和食品加工等多個行業(yè)特別是食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。