魚體新鮮度新型檢測方法的研究進(jìn)展

劉建華，曾倩華，徐霞，丁玉庭*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)2(浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開發(fā)利用重點實驗室， 浙江 杭州，310014)3(國家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(杭州)，浙江 杭州，310014)4(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連，116034)

魚類富含大量優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)，是現(xiàn)代健康飲食的首選產(chǎn)品之一。但是，由于魚體組織肌肉柔軟、蛋白質(zhì)含量高以及體內(nèi)微生物作用等原因，魚體極易發(fā)生腐敗變質(zhì)。因此，對魚體的新鮮度進(jìn)行快速有效的監(jiān)控具有重要的研究意義，有利于鮮魚產(chǎn)品的物流監(jiān)管，減少不必要的產(chǎn)品浪費。

傳統(tǒng)的魚體新鮮度檢測方法主要包括感官評價法、物理評價法、化學(xué)評價法和微生物評價法，其檢測原理和優(yōu)缺點如表1所示。然而，傳統(tǒng)的魚體新鮮度檢測方法費時、耗力且具有破壞性。近幾年來，消費者對于魚體新鮮度新型檢測技術(shù)的需求顯著增加。目前，盡管已經(jīng)報道了部分魚體新鮮度新型檢測技術(shù)，但是對現(xiàn)存的其他魚體新鮮度新型檢測技術(shù)，例如氣味指紋技術(shù)、新鮮度指示型智能包裝技術(shù)、蛋白組學(xué)分析技術(shù)、生物傳感器技術(shù)和光譜技術(shù)尚未進(jìn)行過大量系統(tǒng)的闡述。本綜述對這幾種技術(shù)的優(yōu)缺點進(jìn)行了論述和比較，并概述了當(dāng)前研究中存在的問題和發(fā)展趨勢，為魚體新鮮度評價規(guī)范的制定提供一定的理論依據(jù)，為拓寬魚體新鮮度新型檢測方法的思路提供更多的理論支撐。

表1 魚體新鮮度傳統(tǒng)檢測方法的主要特點與檢測方式Table 1 The main characteristics of traditional detection methods of fish freshness

1 氣味指紋技術(shù)

氣味指紋技術(shù)是指通過使用氣相色譜、質(zhì)譜、氣體傳感器等分析手段與多元的統(tǒng)計方法相結(jié)合，分析食品中的各種揮發(fā)性芳香化合物[1]。常用于魚體新鮮度檢測的氣味指紋技術(shù)包括：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、電子鼻和電子舌等。

1.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)是一種將色譜和質(zhì)譜結(jié)合的在線檢測技術(shù)，它具有色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高定性能力，適用于復(fù)雜揮發(fā)性成分的有效分析[2]。目前，為全面高效地分析魚體中揮發(fā)性成分進(jìn)而判斷魚體品質(zhì)，研究者通常將其與其他檢測技術(shù)聯(lián)合使用，如朱丹實等[3]利用電子鼻結(jié)合頂空固相微萃取和GC-MS技術(shù)分析了貯藏于0 ℃下真鯛魚肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化情況，該研究共檢測出36種揮發(fā)性物質(zhì)，其中右旋檸檬烯、十七烷、姥鮫烷、對二甲苯和萘含量與貯藏時間顯著相關(guān)，可用作真鯛冷藏期間鮮度的揮發(fā)性指示物。相似的是，徐永霞等[4]和李婷婷等[5]采用相同的方法分別對貯藏于4 ℃下的大菱鲆魚肉和三文魚片中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了鑒定與分析，該研究分別發(fā)現(xiàn)，大菱鲆中己醛、庚醛、(E-E)-2，4-庚二烯醛、1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇等物質(zhì)在新鮮魚肉中的含量明顯高于腐敗魚肉，這些物質(zhì)可以作為表征魚肉新鮮度的揮發(fā)性指示物；三文魚片新鮮度變化的拐點是第6天、第12天和第15天，此時間揮發(fā)性成分變化較大，可進(jìn)行新鮮度評價。

采用GC-MS技術(shù)聯(lián)合其他檢測技術(shù)評價魚體新鮮度是未來的發(fā)展趨勢，比如氣相色譜-嗅聞技術(shù)、GC-MS-嗅覺技術(shù)等，它可以彌補(bǔ)單一技術(shù)對魚類產(chǎn)品中揮發(fā)性物質(zhì)測定不全面的不足。但是在研究過程中，需要克服漁獲物的貨架期短、采用多種技術(shù)的檢測結(jié)果復(fù)雜等問題，以期全面、快速且無損地獲得更多魚體新鮮度的揮發(fā)性指示物，實現(xiàn)魚體的鮮度鑒別和貨架期預(yù)測與差異評價。

1.2 電子鼻

電子鼻通過氣體傳感器對被測氣體具有不同的靈敏度，實現(xiàn)對魚體新鮮度評估，這些被測氣體主要是微生物生長和生化反應(yīng)產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物(如醛、酮、酯、硫和氨化合物)[6]。電子鼻具有高效性、可靠性和易操作性，已應(yīng)用于羅非魚、三文魚、帶魚等魚類的新鮮度檢測[7-8]。但是，由于傳感問題和模式識別問題，電子鼻很少被商業(yè)化。例如，金屬氧化物型電子鼻對濕度敏感，需要在高溫條件下工作，不能區(qū)分非常相似的化合物。此外，電子鼻系統(tǒng)需要強(qiáng)大的交叉反應(yīng)傳感和指紋模式識別。因此，GUO等[9]將交叉反應(yīng)比色條形碼與深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(deep convolutional neural networks, DCNN)相結(jié)合，構(gòu)建了一個同時提供氣味指紋和智能指紋識別的電子鼻系統(tǒng)，利用智能手機(jī)APP界面快速、實時無損監(jiān)測肉類新鮮度，總準(zhǔn)確率達(dá)98.5%(圖1)，有望應(yīng)用于魚類新鮮度檢測。

目前，如何使電子鼻商業(yè)化仍有待進(jìn)一步深入研究，想要解決這個問題可以嘗試構(gòu)建一個具有交叉反應(yīng)傳感器陣列和數(shù)據(jù)分析方法的電子鼻系統(tǒng)，完成從非線性數(shù)據(jù)集中提取信息并準(zhǔn)確預(yù)測指紋模式的目標(biāo)。

圖1 交叉反應(yīng)比色條形碼組合學(xué)和深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組合形成用于監(jiān)測肉新鮮度的系統(tǒng)[9]Fig.1 Working principle of the human olfactory system and our system based on colorimetric barcode combinatorics and DCNN[9]

1.3 電子舌

電子舌是根據(jù)模仿人體味覺機(jī)理研制而成，由傳感器陣列、信號采集系統(tǒng)和模式識別系統(tǒng)3部分組成[10]。評估魚體新鮮度時，大多數(shù)研究者將其氣味或味道作為考慮的唯一屬性。其中，鄭舒文等[11]使用電子鼻和電子舌技術(shù)分別檢測了鱈魚的新鮮度，結(jié)果表明，電子舌相比于電子鼻能夠更加明顯地區(qū)分鱈魚的新鮮度等級。事實上，在魚體新鮮度評價過程中，氣味和味道特征同等重要。因此，考慮將電子鼻技術(shù)和電子舌技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于魚體的新鮮度檢測是未來研究趨勢。例如，SHI等[12]證明了利用電子鼻和電子舌綜合評價貯藏于不同溫度下羅非魚片的新鮮度具有可行性和優(yōu)越性，并通過建立主成分分析和徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測貯藏于0～10 ℃下羅非魚片的新鮮度。

電子舌技術(shù)具有高靈敏度、無損檢測、食品感官和安全指標(biāo)檢測限低等優(yōu)勢，正成為魚體傳統(tǒng)檢測方法中一種很有前途的補(bǔ)充技術(shù)。但是，它經(jīng)常受到環(huán)境因素影響，例如溫度會導(dǎo)致傳感器漂移等。并且，電子舌技術(shù)對檢測對象具有局限性，譬如相比于魚肉等固體樣品，其更適用于液體食品的新鮮度監(jiān)測。目前的研究重點是突破電子舌技術(shù)在檢測方面的瓶頸，因此將電子舌技術(shù)與其他數(shù)據(jù)處理方法聯(lián)合使用可以彌補(bǔ)電子舌技術(shù)的不足，比如考慮將電子舌技術(shù)與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法結(jié)合、或?qū)⑵渑c線性和非線性多變量算法結(jié)合等，從多個角度更加全面、詳細(xì)評價魚體新鮮度變化。

2 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器主要包括負(fù)責(zé)檢測生物成分的生物識別元件和將特定生化信息轉(zhuǎn)換為電、熱或光信號的物理或化學(xué)傳感器，其特異性主要基于生物結(jié)合反應(yīng)[13]。目前，應(yīng)用于檢測魚體新鮮度的生物傳感器包括：酶傳感器和微生物傳感器。

2.1 酶傳感器

在酶傳感器中，電極上的固定化酶可以與目標(biāo)材料發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生電活性物質(zhì)。電極將電活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為電信號，通過得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出目標(biāo)濃度[14]。目前，檢測魚體新鮮度的酶傳感器通常使用黃嘌呤氧化酶作為酶識別元件。比如，MUSTAFA等[15]開發(fā)了一種利用黃嘌呤氧化酶(xanthione oxidase，XOD)使次黃嘌呤(hypoxanthine，HX)發(fā)生酶轉(zhuǎn)化，測量HX的酶傳感器(圖2)，其測量水平可與商用HX檢測試劑盒相媲美。它是一種新型的魚體新鮮度實時檢測方式，在檢測過程中不需要添加外源試劑或使用復(fù)雜的實驗室設(shè)備。最近，ZHU等[16]采用激光直寫技術(shù)，在聚酰亞胺上制備了三維多孔石墨烯柔性納米酶電極，該電極對黃嘌呤(0.3～179.9 μmol/L)和HX(0.3～159.9 μmol/L)具有酶類動力學(xué)特征，檢出限分別為0.26 μmol/L和0.18 μmol/L。通過對XT和HX同時檢測，并結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法建立機(jī)器學(xué)習(xí)模型，實現(xiàn)對魚體新鮮度的智能分析和數(shù)字輸出。

酶傳感器具有成本低、準(zhǔn)確度高、精密度好、靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點。但是，它會出現(xiàn)電極表面缺乏再現(xiàn)性、工作電極表面鈍化等問題。在今后研究中，酶傳感器的傳感材料改進(jìn)和電極選擇是亟待解決的問題，比如考慮如何將納米材料、納米材料與高分子材料的復(fù)合以及碳基納米材料等應(yīng)用于酶傳感器。此外，促進(jìn)其向微型化和智能化方向發(fā)展，也是酶傳感器的發(fā)展趨勢。

圖2 XOD生物傳感器概念設(shè)計和操作[15]Fig.2 The conceptual design and operation of the XOD biosensor[15]

2.2 微生物傳感器

微生物傳感器由固定化微生物與電化學(xué)裝置組成[17]，根據(jù)微生物的呼吸或代謝作用產(chǎn)生電流、電壓、電導(dǎo)的變化進(jìn)行測定。HOSHI等[18]構(gòu)建了由固定在膜內(nèi)的腐敗交替單胞菌、流動池、氧電極、蠕動泵、緩沖罐、恒溫控制浴和記錄器組成的微生物傳感器系統(tǒng)。通過檢測藍(lán)鰭金槍魚肉表面的化學(xué)成分和傳感器電流衰減率來評價魚肉鮮度品質(zhì)，一次檢測時間只需13 min。

微生物傳感器系統(tǒng)利用引起新鮮度變化的整體化學(xué)和酶反應(yīng)，能夠快速、準(zhǔn)確評價魚體新鮮度。此外，微生物傳感器應(yīng)用于確定魚肉口味和肉類老化方面需要大量的研究工作，其發(fā)展受限于生物識別元件(微生物細(xì)胞)，這一難題也值得研究者深入探討。

3 光譜技術(shù)

光譜技術(shù)利用物質(zhì)的吸收光譜、發(fā)射光譜或散射光譜特征來研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成，在檢測魚類的病原菌、外來污染、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、脂質(zhì)氧化和腐敗監(jiān)測等方面也展現(xiàn)出巨大的潛力[19]。

3.1 可見/近紅外光譜技術(shù)

可見/近紅外光輻射可用于測定魚體的有機(jī)官能團(tuán)的吸收強(qiáng)度[20]，與傳統(tǒng)檢測方法相比，可見/近紅外光譜技術(shù)適用范圍廣、樣品量使用少、對環(huán)境友好和可重復(fù)使用。但是，不同貯藏條件的樣品需要不同的模型，常需要校準(zhǔn)。

REIS等[21]使用可見/近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)區(qū)分新鮮和凍融金槍魚片，實驗表明新鮮樣品和凍融樣品被正確檢測的概率分別為92%和82%。但是，在偏最小二乘回歸法建模之前，為消除散射和失真等噪聲，需要對頻譜進(jìn)行預(yù)處理。為了解決上述問題，WU等[22]采用可見/近紅外光譜技術(shù)和雙層疊加去噪自編碼神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對低溫箱中三文魚魚肉和魚皮的新鮮度進(jìn)行測定。結(jié)果表明，此方法不需要預(yù)處理，在降低噪聲和優(yōu)化初始權(quán)值方面具有更好效果，并且準(zhǔn)確性較高(R2=0.98，RMSEP=0.93 d)。因此，將可見/近紅外光譜技術(shù)與化學(xué)計量學(xué)方法以及機(jī)器學(xué)習(xí)方法相結(jié)合，建立適合不同條件下魚樣品的分析模型，為光譜技術(shù)應(yīng)用于魚體新鮮度檢測提供多種新的可能性。

3.2 高光譜成像技術(shù)

高光譜成像技術(shù)(hysperspectral image，HSI)將計算機(jī)視覺和可見/近紅外光譜技術(shù)結(jié)合，得到同時具有光譜和空間信息的三維數(shù)據(jù)集[23]。其中，張文娣等[24]和章海亮等[25]采用HSI技術(shù)分別對不同解凍方式下的大口黑鱸魚和多寶魚的新鮮度進(jìn)行檢測，并準(zhǔn)確檢測出不同凍融次數(shù)和冷凍時間。然而，利用HSI技術(shù)對新鮮魚、冷藏魚和凍融魚的貯藏時間同時進(jìn)行預(yù)測和可視化的研究還很少。最近，CHEN等[26]利用HSI技術(shù)了實現(xiàn)了珍珠龍膽石斑魚在不同貯藏條件下貯藏時間的快速準(zhǔn)確預(yù)測和分布可視化。采用PLS-DA和競爭自適應(yīng)重加權(quán)-偏最小二乘判別分析(competitive adaptive reweighted sampling-partial least squares-discrimination analysis, CARS-PLS-DA)對新鮮魚、冷藏魚和凍融魚進(jìn)行分類(圖3)。結(jié)果表明，PLS-DA分類結(jié)果總體較好，新鮮、冷藏和冷凍樣品的準(zhǔn)確率分別為100%、96.43%和96.43%。

HSI是一種快速、無損、可靠的新鮮度在線評估工具，并且可以檢測魚肉變質(zhì)的變化模式。HSI與化學(xué)計量學(xué)聯(lián)用對魚體新鮮度檢測是目前主要的發(fā)展趨勢，例如考慮將深度學(xué)習(xí)算法與HSI聯(lián)合使用是一個可研究方向。

圖3 數(shù)據(jù)處理流程圖[26]Fig.3 Workflow chart for data processing[26]

3.3 熒光光譜技術(shù)

樣品中熒光化合物被短波長的光激發(fā)后，把能量儲存起來，緩慢發(fā)射出較長波長的光，這種光稱為熒光，熒光光譜技術(shù)將熒光強(qiáng)度作為發(fā)射波長的函數(shù)來測量[27]。熒光光譜技術(shù)對魚類等食品可進(jìn)行快速、非接觸和非破壞性分析，測量的濃度是正常吸收光譜的千分之一。其中，前表面熒光光譜(front-face fluorescence spectroscopy，F(xiàn)FFS)技術(shù)以特定的入射角度照射魚類樣品，獲得包含理化和質(zhì)構(gòu)信息的熒光光譜，完成對魚體新鮮度的檢測[28]。如KAROUI等[29]采用前表面熒光光譜技術(shù)結(jié)合因子判別分析模型成功鑒別了新鮮鱸魚和凍融鱸魚，正確率達(dá)92%。HASSOUN等[30]采用前表面熒光光譜技術(shù)結(jié)合物理化學(xué)方法評估鱈魚在不同條件下貯藏12 d的鮮度變化，正確率可達(dá)90.5%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色氨酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的熒光強(qiáng)度與硫代巴比妥酸反應(yīng)物呈良好的相關(guān)性。

FFFS技術(shù)具有快速采集數(shù)據(jù)和替代昂貴、耗時的檢測技術(shù)的能力，以及可同時確定多個參數(shù)的潛力。隨著化學(xué)計量學(xué)工具的廣泛應(yīng)用，F(xiàn)FFS技術(shù)在評價魚類新鮮度方面的潛力不斷增加，未來可嘗試應(yīng)用于大量樣本以及多脂魚類等。

3.4 拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜技術(shù)以拉曼散射效應(yīng)為基礎(chǔ)，不僅能夠檢測完整細(xì)胞和組織內(nèi)生化分子的濃度、結(jié)構(gòu)和相互作用，而且可以檢測魚體肌肉中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)并獲得基團(tuán)的強(qiáng)度和位置變化[31]。拉曼光譜技術(shù)檢測魚體新鮮度具有無損檢測、樣品使用量少、和不需要前處理等特點。但是檢測過程中，拉曼散射的微弱影響、生物熒光背景信號的強(qiáng)干擾以及激光產(chǎn)生的一些熱量，可能會影響評估的有效性。同時，它不適合發(fā)射強(qiáng)熒光的材料，并且由于強(qiáng)可見激光照射，不穩(wěn)定的化合物通常會遇到光分解和光異構(gòu)化。目前，拉曼光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法已應(yīng)用于魚類的質(zhì)量評估。比如，VELIOGLU等[32]利用拉曼光譜結(jié)合主成分分析，成功地對來自6種凍融魚(竹莢魚、歐洲鳀魚、紅鯔魚、藍(lán)魚、大西洋鮭魚和飛魚)進(jìn)行了物種鑒別及新鮮度分析。在今后研究中，嘗試將拉曼光譜與化學(xué)計量學(xué)方法聯(lián)合應(yīng)用于其他魚種，是魚體新鮮度新型檢測技術(shù)發(fā)展的一個前進(jìn)方向。

4 新鮮度指示型智能包裝技術(shù)

新鮮度指示型智能包裝由一個傳感元件組成，該元件與食物代謝物相互作用，并在食品品質(zhì)變化時顯示出明顯的顏色變化[33]。在各種傳感元件中，pH染料是智能包裝中最常用的一種。在貯存過程中，腐爛的魚產(chǎn)生揮發(fā)性胺會改變包裝內(nèi)環(huán)境的pH值，導(dǎo)致pH染料的顏色發(fā)生變化，工作原理如圖4所示[34]。近年來，應(yīng)用于檢測魚體新鮮度的指示型智能包裝以其智能化、實時監(jiān)控魚體新鮮度的功能而備受關(guān)注，但是未對其進(jìn)行過系統(tǒng)的闡述。表2總結(jié)了近幾年新鮮度指示型智能包裝應(yīng)用于檢測魚體新鮮度實例。

圖4 新鮮度指示膜顏色變化示意圖(以姜黃素為例)[34]Fig.4 Schematic of the changes in the freshness indicator intelligent food packaging films′color[34]

表2 新鮮度指示型智能包裝應(yīng)用于檢測魚體新鮮度實例Table 2 Examples of smart packaging for fish freshness detection

4.1 化學(xué)合成指示劑型

用于監(jiān)測魚類新鮮度的化學(xué)合成指示劑具有對酸堿度變化敏感、價格低廉、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、毒性低、可工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。最初，應(yīng)用于檢測魚體新鮮度的指示型智能包裝大多數(shù)使用化學(xué)合成指示劑。如WANG等[43]使用聚苯胺薄膜作為食品包裝比色標(biāo)簽，檢測羅非魚的新鮮度(圖5)。研究表明，聚苯胺的顏色變化與揮發(fā)性鹽基氮有很好的相關(guān)性。這類比色標(biāo)簽生產(chǎn)量大、成本低、可再生，并且無需額外的技術(shù)支持(如射頻識別)即可使用。但是，聚苯胺檢測的靈敏度影響了其顯色效果。因此，LIU等[35]利用聚苯胺和四苯乙烯研制了1種高靈敏度比色熒光雙模式傳感標(biāo)簽。當(dāng)魚體發(fā)生腐敗變質(zhì)時，傳感標(biāo)簽不僅顯示出從翡翠綠變?yōu)榭兹杆{(lán)，而且在紫外線照射下，熒光信號從黑色變?yōu)榱了{(lán)色。此標(biāo)簽在室溫下和冷藏溫度下的靈敏度分別是普通傳感標(biāo)簽的2.5倍和3.4倍。但是在應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，這類指示劑的靈敏性和精確度仍有待提高，并且存在安全隱患。

圖5 羅非魚揮發(fā)性鹽基氮變化及聚苯胺薄膜的顏色變化(4 ℃)[43]Fig.5 TVB-N changes and colour changes of doped polyaniline films sealed in tilapia samples(4 ℃)[42]

4.2 天然色素指示劑型

近年來，研究者已經(jīng)認(rèn)識到化學(xué)合成指示劑的潛在毒性和危害，研究重點開始轉(zhuǎn)移到天然的酸堿度傳感染料上，它們具有無毒、可生物降解和響應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點。最近，EZATI等[44]將天然萘醌色素紫草素吸附在纖維素紙上，制備了1種新型智能pH響應(yīng)型顏色指示劑，用于監(jiān)測魚肉在室溫下的新鮮度，結(jié)果表明指示劑的顏色變化與樣品的新鮮度變化有很高的相關(guān)性。此外，該指示劑在貯存4個月后顯示出高穩(wěn)定性。ZHAI等[45]采用溶劑蒸發(fā)法將淀粉/聚乙烯醇(starch/polyvinyl alcohol, SPVA)與玫瑰花青素(roselle anthocyanins, RACNs)不同比例結(jié)合，制備酸堿度傳感膜用于監(jiān)測冷藏期間鰱魚的新鮮度。結(jié)果表明，不同比例組成的比色膜呈現(xiàn)出不同變色效果，在冷藏溫度和室溫下穩(wěn)定長達(dá)14 d，相對顏色變化小于5%(圖6)。類似的是，ZENG等[38]以明膠/聚乙烯醇為基質(zhì)，加入從桑椹中提取的花青素，制備魚體新鮮度比色指示膜。在檢測過程中，該膜由鮮紅色變?yōu)樯罹G色，明顯反映了魚類在貯藏過程中的新鮮度和腐敗程度。

天然色素指示劑為檢測魚的新鮮度變化提供了一種簡單而直觀的方法，不僅對人體健康無損，而且也有助于降低成本和保護(hù)環(huán)境。但是，目前發(fā)現(xiàn)可用作指示劑的天然色素較少，如何從天然水果和蔬菜中提取色素用作指示劑仍需進(jìn)一步深入地探索。

圖6 比色膜顏色變化[45]Fig.6 The color changes of the colorimetric films[45]

5 蛋白組學(xué)分析技術(shù)

魚死后，內(nèi)源酶催化蛋白質(zhì)發(fā)生水解反應(yīng)，過程中產(chǎn)生了促進(jìn)細(xì)菌增殖的營養(yǎng)物質(zhì)，因此從魚體肌肉蛋白質(zhì)的降解、聚合和變性角度分析可能是評價魚體新鮮度的一個重要途徑[46]。目前越來越多的學(xué)者開始利用蛋白組學(xué)分析技術(shù)，對魚體品質(zhì)進(jìn)行檢測，并對其變化機(jī)理進(jìn)行詳細(xì)的解釋說明。蛋白組學(xué)技術(shù)以傳統(tǒng)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳為基礎(chǔ)，更多研究者在此基礎(chǔ)上加入了等電點分離和質(zhì)譜技術(shù)，即二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，目的是了解與研究魚體肌肉中的蛋白信息。如LI等[47]采用二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從4 ℃下貯藏18 d的大菱鲆肌肉中篩選并確定出7種蛋白，這些蛋白可作為大菱鲆的新鮮度變化標(biāo)記物。相似的是，ETHUIN等[48]采用相同技術(shù)區(qū)分新鮮和凍融海鱸魚，發(fā)現(xiàn)小清蛋白亞型可能是區(qū)分新鮮鱸魚和凍融鱸魚魚片的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。目前，采用二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從分子水平揭示魚體新鮮度變化顯示出相當(dāng)大的潛力。但是，二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在蛋白質(zhì)鑒定中也存在部分缺陷，例如太大或太小的蛋白質(zhì)、極度疏水和低豐度的蛋白質(zhì)很難識別。

近幾年，多肽體外標(biāo)記技術(shù)在研究魚體中不同差異蛋白方面具有突出優(yōu)勢。其中，馬聰聰?shù)萚49]利用定量蛋白組學(xué)技術(shù)分析貯藏于0 ℃下不同貯藏時間的三文魚肌肉蛋白，篩選出28個可能與三文魚貯存期間鮮度品質(zhì)變化相關(guān)的差異蛋白，并利用多反應(yīng)檢測模式對這些蛋白進(jìn)行了驗證，為揭示不同貯藏時間下三文魚新鮮度變化機(jī)理提供一定理論支撐。ZHANG等[50]采用TMT(tandem mass tag)技術(shù)研究了冷藏期間石斑魚魚片的蛋白質(zhì)變化。研究發(fā)現(xiàn)，在第0 d、6 d和12 d共有64個顯著性差異表達(dá)的蛋白，并找到與石斑魚魚片的pH值、離心損失、顏色(L*、a*、b*)和質(zhì)地(硬度、咀嚼性和膠質(zhì))變化密切相關(guān)的蛋白質(zhì)。為研究石斑魚魚片在冷藏過程中蛋白質(zhì)的變化及新鮮度下降的機(jī)理奠定一定基礎(chǔ)。

目前，使用新型蛋白質(zhì)標(biāo)記定量技術(shù)評價魚體的新鮮度研究還較少，未來有待進(jìn)一步深入探索。與基礎(chǔ)的二維電泳技術(shù)相比，新型蛋白質(zhì)標(biāo)記定量技術(shù)提高了多個樣品檢測的準(zhǔn)確性，降低了實驗誤差，克服了二維電泳測定的缺點。蛋白組學(xué)技術(shù)的不斷突破為開發(fā)魚體新鮮度新型檢測技術(shù)提供了新的契機(jī)，為從新鮮度機(jī)理層面研究新鮮度變化、實現(xiàn)漁獲物冷鏈物流過程中新鮮度變化的實時監(jiān)測奠定理論基礎(chǔ)。

6 總結(jié)與展望

綜上所述，現(xiàn)存的新型魚體新鮮度檢測技術(shù)具有無損、全面和快速等優(yōu)勢，但是魚體的腐敗變質(zhì)受多種因素影響，僅憑單一的技術(shù)無法精確評價各個時期魚體的新鮮度。在實際操作中，從魚體的視覺、嗅覺和味覺多個傳感角度全面評價魚體的新鮮度更加符合未來的研究趨勢。近年來，通過將氣味指紋技術(shù)與智能技術(shù)、光譜技術(shù)與化學(xué)計量學(xué)以及蛋白組學(xué)與質(zhì)譜技術(shù)等聯(lián)用的方法，全面、精確地評價魚體的新鮮度的相關(guān)研究仍處于發(fā)展階段，如何使其真正應(yīng)用于市場有待進(jìn)一步深入研究。另一方面，對魚體新鮮度的檢測大多停留在宏觀水平，而最新研究表明，對蛋白結(jié)構(gòu)的研究促進(jìn)了魚體新鮮度機(jī)理不斷發(fā)展，如何從宏觀和分子水平上共同探究魚體新鮮度變化，實現(xiàn)多種新型檢測技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)相結(jié)合，得到多指標(biāo)融合的檢測結(jié)果也是需要重點考慮的問題。

在未來的研究中，為進(jìn)一步拓寬新技術(shù)的廣度和深度，可從以下幾個方面開展研究：(1)氣味指紋技術(shù)與智能技術(shù)聯(lián)用時，建立適合不同條件下魚樣品的氣味指紋圖譜庫，探索并使用智能技術(shù)處理氣味信號，改善數(shù)據(jù)處理的局限性，達(dá)到對新鮮度檢測和控制的目的，推動其向更精準(zhǔn)化的方向發(fā)展；(2)生物傳感器技術(shù)需要提高測量精確性和靈敏性，減少前處理時間，并完成可重復(fù)性，根據(jù)不同處理條件和品種建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型進(jìn)而判斷新鮮度，嘗試添加與配備具有彩色閱讀軟件的智能便攜設(shè)備，開發(fā)多傳感器多指標(biāo)融合檢測技術(shù)，促進(jìn)其向取代化學(xué)檢測方法方面發(fā)展；(3)對于光譜技術(shù)，進(jìn)一步開發(fā)與優(yōu)化算法和化學(xué)計量學(xué)，嘗試將其與氣味指紋技術(shù)等聯(lián)用，同時降低設(shè)備成本、促進(jìn)設(shè)備智能化和微型化，建立完善的光譜檢測模型庫，擴(kuò)大該技術(shù)在魚體新鮮度在線檢測中的推廣應(yīng)用；(4)對于新鮮度指示型智能包裝技術(shù)，開發(fā)高靈敏、低成本的天然指示劑，將納米復(fù)合材料應(yīng)用于指示劑膜的制備以提高其抗菌性和抗氧化能力，嘗試多指示劑組合形式監(jiān)測魚體腐敗變質(zhì)情況，提高消費者認(rèn)可度，使其逐步走出實驗室，真正應(yīng)用于市場；(5)蛋白組學(xué)技術(shù)不僅可與代謝組學(xué)等其他組學(xué)技術(shù)聯(lián)用，同時結(jié)合生物信息學(xué)，確定更多的魚體新鮮度變化標(biāo)記物和標(biāo)志代謝物，而且可與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用以開發(fā)新型蛋白質(zhì)標(biāo)記定量技術(shù)，從魚體的蛋白結(jié)構(gòu)方面研究新鮮度機(jī)理，為研發(fā)魚體新鮮度變化試劑盒和蛋白質(zhì)變性的控制技術(shù)提供更多的可能性。