大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法快速測(cè)定四種果蔬中阿維菌素農(nóng)藥殘留

曾定玲，方長(zhǎng)發(fā)，顧亞萍，潘劍蕾，林慧純，張曉強(qiáng)，張曉鴻，王鈺歆

1(深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東 深圳，518040)2(深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳，518055)

阿維菌素是目前農(nóng)業(yè)應(yīng)用較多的微生物源殺蟲(chóng)、殺螨、殺菌劑的一種,屬于土壤微生物阿維鏈霉菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，近年來(lái)被大量用于農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中，是種植業(yè)害蟲(chóng)防治體系中理想的生物農(nóng)藥[1-4]。然而，對(duì)于阿維菌素這類高毒農(nóng)藥，不合理的施藥行為會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中的農(nóng)藥污染以及農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，從而影響到人們的身體健康，甚至還可能會(huì)引起食物中毒現(xiàn)象[5-6]。因此，我國(guó)規(guī)定阿維菌素在番茄、韭菜、結(jié)球甘藍(lán)等蔬菜以及柑橘類等水果中的最大殘留量為0.010～0.50 mg/kg[7]。

在農(nóng)殘檢測(cè)中用于檢測(cè)蔬果中阿維菌素的標(biāo)準(zhǔn)方法雖多[8-10]，但標(biāo)準(zhǔn)方法的樣品前處理涉及到的步驟較為繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，當(dāng)需要進(jìn)行大量樣品檢測(cè)時(shí)，將加大檢測(cè)人員的任務(wù)量，影響檢測(cè)時(shí)效。根據(jù)目前研究趨勢(shì)，對(duì)阿維菌素的檢測(cè)方法主要有：高效液相色譜紫外檢測(cè)[11-12]、高效液相色譜熒光檢測(cè)[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)[15-16]。其中，紫外和熒光法檢出限欠佳，前處理復(fù)雜甚至需進(jìn)行衍生。質(zhì)譜法分析時(shí)間長(zhǎng)，且研究大多數(shù)圍繞電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)源展開(kāi)，方法檢出限高但不穩(wěn)定，結(jié)果易受提取樣品中鈉含量的影響，線性不佳，故普適性不高[17-18]。

在越來(lái)越注重食品安全的當(dāng)下，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)管力度在不斷加強(qiáng)，建立一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法，以解決日常檢測(cè)多種農(nóng)藥殘留面臨的基質(zhì)干擾、檢測(cè)時(shí)效低等問(wèn)題顯得極其重要。

前處理方法中，QuEChERS法高效便捷，適合大批量樣品的篩查，同時(shí)，相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，與ESI接口相比，大氣壓化學(xué)電離(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)接口的基質(zhì)效應(yīng)較小[19]。因此本研究將二者結(jié)合，建立了一種新的阿維菌素檢測(cè)方法。方法性能測(cè)試的結(jié)果顯示，該方法檢測(cè)穩(wěn)定性好、基質(zhì)效應(yīng)低、回收率精密度符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。因此，本方法是一種適用于日常大批量蔬果中阿維菌素快速定量檢測(cè)的方法，可滿足農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的快篩監(jiān)測(cè)的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)室用番茄，結(jié)球甘藍(lán)，韭菜和橙子，是經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)后得到的空白樣品，所選的樣品均經(jīng)勻漿機(jī)打漿裝瓶貼標(biāo)簽后冷凍于-18 ℃條件下，備用。

阿維菌素農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(1 000 mg/L)，天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)中心；乙酸銨、甲酸(均為優(yōu)級(jí)純)，安譜科學(xué)儀器有限公司(上海)；固體氯化鈉(分析純)，西隴化工股份有限公司；甲醇、乙腈(均為4 L容量色譜純)，德國(guó)默克公司；實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水；丙基乙二胺(primary-secondary amine，PSA)粉(100 mg)，成分為N-丙基乙二胺固相吸附劑，美國(guó)安捷倫有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple Quad 5500型液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(軟件為Analyst)，可根據(jù)檢測(cè)情況替換離子源，配有APCI等2種接口裝置，美國(guó)AB SCIEX公司；N-EVAP 112型氮吹儀，美國(guó)Organomation Associates公司；Elix5型純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；XH-B型旋渦混合儀，康健醫(yī)療器具有限公司；TG16G型臺(tái)式高速離心機(jī)，凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；BS200S-WEI型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；AS30600BDT型超聲波清洗機(jī)，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；聚四氟乙烯濾膜(0.22 μm孔徑)、棕色液相小瓶(規(guī)格：2 mL)，安捷倫科技有限公司；HY-5型回旋式振蕩器，江蘇省金壇市宏華儀器廠；KS4000i型控溫?fù)u床，德國(guó)IKA公司；AUTO-HOMOGEZER型自動(dòng)勻漿機(jī)，Hestix Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(20 mg/L)：準(zhǔn)確移取阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.00 mL于50.00 mL的容量瓶，使用甲醇(色譜純)定容，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液保存于-18 ℃條件下，備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(0.080 mg/L)：準(zhǔn)確移取上述配制的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(20 mg/L)0.10 mL于25.00 mL容量瓶中，使用配制的甲醇-水溶液(體積比1∶1)定容至刻度線，現(xiàn)配現(xiàn)用。

阿維菌素純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)工作曲線：使用移液管準(zhǔn)確移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(20 mg/L)，使用配制的甲醇-水(體積比1∶1)溶液稀釋至0.012 5、0.025、0.050、0.10、0.20、0.40 mg/L，放置于0～4 ℃環(huán)境下待測(cè)。

5 mmol/L乙酸銨(含體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲酸)溶液：使用電子天平準(zhǔn)確稱取固體乙酸銨0.392 g，吸取0.50 mL甲酸溶液，加水稀釋至1 000 mL刻度，經(jīng)5 min超聲脫氣后作為樣品上機(jī)時(shí)的流動(dòng)相使用。

1.3.2 樣品處理與凈化

參照以往改良的QuEChERS法[20]，將冷凍的空白樣品在常溫下進(jìn)行解凍后，充分?jǐn)嚢杈鶆?。使用電子天平?zhǔn)確稱取各類果蔬樣品(10±0.1) g，置于50 mL 的尖底塑料離心管中，管中添加20 mL的乙腈，設(shè)置勻漿機(jī)轉(zhuǎn)速為12 000 r/min勻漿2 min后加入3 g氯化鈉，充分振蕩30 min，使氯化鈉混合溶解。將該塑料離心管置于10 000 r/min高速離心機(jī)中離心3 min后，準(zhǔn)確移取2 mL上清液于15 mL塑料離心管中，添加100 mg PSA粉充分混合凈化1 min后，在轉(zhuǎn)速為9 000 r/min的高速離心機(jī)上離心1 min。

移取上清液1 mL于氮吹儀上50 ℃條件下緩緩吹至近干，得到各類樣品基質(zhì)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中嚴(yán)格控制樣品瓶保存溫度為4 ℃，以此減少樣品瓶中溶劑的揮發(fā)。

1.3.3 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將選定的4種樣品按1.3.2的方法處理后，得到4種空白基質(zhì)。分別用1.3.1所配制的系列純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)工作液定容至2.00 mL，依次配制得到0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將以上系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)孔徑0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾至2 mL容量的液相小瓶中，按照設(shè)定的儀器條件上機(jī)測(cè)定，以待測(cè)阿維菌素的峰面積作為縱坐標(biāo)，選擇相對(duì)應(yīng)的添加濃度作為橫坐標(biāo)，以此繪制阿維菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 檢測(cè)方法的穩(wěn)定性

將1.3.1配制的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(0.080 mg/L)在APCI模式下按照標(biāo)準(zhǔn)工作液、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的順序進(jìn)樣，考慮該模式下的掃描時(shí)間，每間隔1 h對(duì)阿維菌素檢測(cè)方法穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

其中統(tǒng)計(jì)每間隔時(shí)間點(diǎn)連續(xù)進(jìn)樣2次的平均峰面積[20]，某時(shí)間段的穩(wěn)定性計(jì)算如公式(1)所示：

某時(shí)間段的穩(wěn)定性/%

(1)

1.3.5 方法的正確度及精密度

結(jié)合回收率研究正確度，分別將番茄、結(jié)球甘藍(lán)、韭菜和橙子空白樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，考察檢測(cè)方法的正確度和精密度。準(zhǔn)確稱取4種空白基質(zhì)10 g(精確到0.001 g)至50 mL塑料離心管中，分成5個(gè)平行樣，分別添加標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(20 mg/L)0.050、0.100 mL，即添加水平為0.1、0.2 mg/kg，混勻后同1.3.2節(jié)方法進(jìn)行樣品處理后，甲醇-水(體積比1∶1)定容2.00 mL，過(guò)膜上機(jī)，計(jì)算上機(jī)所測(cè)定的加標(biāo)回收數(shù)據(jù)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 液相色譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；柱溫設(shè)置：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；設(shè)定流速：0.60 mL/min；流動(dòng)相管路A：水，流動(dòng)相管路B：甲醇(色譜純)；流動(dòng)相梯度洗脫程序：0～1.5 min 20%B逐漸升至50%B；1.5～4.5 min 95%B；4.5～4.6 min 95%B逐漸下降至20%B；4.5～6.5 min 20%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子監(jiān)測(cè)模式：APCI-；氣簾氣：40 psi；碰撞氣壓力：8 psi；離子化電壓：-4 500 V；源溫：550 ℃；噴霧氣：55 psi。

質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)詳見(jiàn)表1。

表1 阿維菌素液質(zhì)質(zhì)多離子掃描檢測(cè)參數(shù)(APCI)Table 1 The LC-MS-MS multiple reaction monitoring parameters of avermectin(APCI)

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的檢測(cè)穩(wěn)定性

為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，考察方法檢測(cè)過(guò)程中的穩(wěn)定性是確證方法的必要指標(biāo)。在以往檢測(cè)中，多采用甲醇、乙腈、乙腈-水和甲醇-水作為定容溶劑上機(jī)，但是研究表明，定容體系中使用甲醇-水(1∶1，體積比)時(shí)可以在長(zhǎng)時(shí)間(11 h)的檢測(cè)中展現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性[21]。故本文采用50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水進(jìn)行置換溶劑再上機(jī)，以減少溶劑因素對(duì)檢測(cè)穩(wěn)定性的影響。

由圖1可知，按1.3.1處理的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在APCI上每隔1 h檢測(cè)的前后2次峰面積的比值均在5%以下。這表明，阿維菌素在該方法上呈現(xiàn)出的穩(wěn)定性高。

圖1 APCI模式下阿維菌素檢測(cè)穩(wěn)定性(5 h內(nèi))Fig.1 The stability of avermectin detection under APCI mode (in 5 h)

2.2 方法的線性方程及基質(zhì)效應(yīng)

本文測(cè)定過(guò)程前處理上選擇采用分散固相萃取，為了避免儀器檢測(cè)時(shí)引入更多基質(zhì)，對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后上機(jī)，以降低基質(zhì)帶來(lái)的影響。

由表2可知,按照1.3.3方法處理，在空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相應(yīng)的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線0.012 5～0.40 mg/L，4種基質(zhì)添加阿維菌素質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積間的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

本文參考國(guó)內(nèi)外研究中表示基質(zhì)效應(yīng)的方法，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線及斜率比值法評(píng)價(jià)阿維菌素在各樣品上的基質(zhì)效應(yīng)[22-25]。當(dāng)純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與各基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值為1.0±0.2時(shí)，表示所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)[26]。其中斜率比值越趨向1.0，表示所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)越小；當(dāng)比值大于1.0時(shí)，表示基質(zhì)有增強(qiáng)作用；而比值小于這個(gè)范圍時(shí)，則表示基質(zhì)產(chǎn)生了抑制作用。

結(jié)果如表2所示，4種基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)在0.97～1.05，這意味著基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計(jì)，同時(shí)解決了以往研究中檢測(cè)阿維菌素的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)低的問(wèn)題[20]。因此，在此方法上不同的果蔬樣品產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)總體較弱，影響較小，幾乎可以用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)行測(cè)定。

表2 APCI上阿維菌素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和基質(zhì)效應(yīng)(線性范圍：0.012 5～0.40 mg/L)Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients and matrix effects of avermectin on APCI (0.012 5-0.40 mg/L)

2.3 四種基質(zhì)在APCI中的添加回收試驗(yàn)

由表3可知，在0.01、0.1、0.2 mg/kg 3水平加標(biāo)回收試驗(yàn)中，4種基質(zhì)中添加的阿維菌素平均回收率均為93.3%～100.8%，得到RSD為1.8%～5.7%。通過(guò)分析各基質(zhì)中阿維菌素的結(jié)果可知，該方法檢測(cè)阿維菌素精密度高，回收率理想且穩(wěn)定，滿足阿維菌素農(nóng)藥殘留分析測(cè)試的要求[27-28]。

3 結(jié)論

本文對(duì)測(cè)定果蔬中阿維菌素的大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法結(jié)合改良的樣品前處理法(QuEChERS-LC-APCI-MS-MS)進(jìn)行了可行性的研究，同時(shí)考察了檢測(cè)過(guò)程中的穩(wěn)定性、基質(zhì)效應(yīng)以及方法準(zhǔn)確度等指標(biāo)。結(jié)果表明，該方法在4種基質(zhì)中添加3水平加標(biāo)回收試驗(yàn)中，精密度高(1.8%～5.7%)，回收率穩(wěn)定(93.3%～100.8%)，且5 h內(nèi)檢測(cè)阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性良好(比值<5%)，以及在0.012 5～0.40 mg/L 表現(xiàn)出理想的線性關(guān)系(r2≥0.99)，幾乎不存在基質(zhì)效應(yīng)(斜率比：0.97～1.05)，這意味著，在茄果、蕓薹屬、鱗莖和柑橘類四類農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素殘留檢測(cè)過(guò)程中可省略相應(yīng)基質(zhì)配標(biāo)的步驟，直接使用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量。由于實(shí)驗(yàn)測(cè)算整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需0.48 h，還可同一時(shí)間處理多個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)便，基質(zhì)影響小，方法穩(wěn)定，準(zhǔn)確快捷，不失為一種大批量農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素的理想初篩方法。但是，本實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了4種果蔬基質(zhì)中阿維菌素的方法性能指標(biāo)的研究，考慮到農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)類型的復(fù)雜性，本研究后續(xù)將對(duì)其他基質(zhì)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以考察方法的適用性范圍。同時(shí)由于APCI接口有適合分析中等極性到弱極性化合物的特性，該方法能否作為多種農(nóng)藥的理想篩查方法還有待研究。

表3 阿維菌素在APCI中4種基質(zhì)的添加回收率和RSD(n=5)