分散固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法快速測定蜂蜜中112種農(nóng)藥殘留

鄭劍峰， 董葉箐， 俞婕， 鐘寒輝， 韋棟屹， 虞祖苗， 孫文閃

(綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310051)

蜂蜜是一種純天然的滋養(yǎng)食品，富含果糖、葡萄糖、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、生物酶等營養(yǎng)成分，具有增強(qiáng)免疫力、殺菌、保護(hù)肝臟、促進(jìn)胃腸蠕動以及改善睡眠等保健功能，在食品行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用，然而蜂農(nóng)不恰當(dāng)?shù)厥褂棉r(nóng)藥和蜜蜂采集被農(nóng)藥污染的花粉，可能導(dǎo)致農(nóng)藥在蜂蜜中殘留甚至超標(biāo)。研究表明，世界上超過75%的蜂蜜存在農(nóng)藥殘留[1]。我國是蜂蜜養(yǎng)殖大國，每年蜂蜜總產(chǎn)量超50萬t，占世界蜂蜜總產(chǎn)量的1/4以上[2]，同時蜂蜜也是我國的傳統(tǒng)出口商品之一，日本、美國和歐盟等國家和地區(qū)都對蜂蜜中的有機(jī)磷和菊酯類農(nóng)藥制定了最大殘留限量，并且不斷對蜂蜜農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)則進(jìn)行調(diào)整[3]。作為蜂蜜出口大國，我國也出臺了蜂蜜相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)及蜂蜜中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。加強(qiáng)對蜂蜜中農(nóng)藥殘留的檢測具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，既可以保護(hù)人們的身體健康，又有利于蜂蜜的出口貿(mào)易。因此，建立一種簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的蜂蜜中多種農(nóng)藥殘留的檢測方法，對于保障人民舌尖上的安全非常重要。

目前，蜂蜜中農(nóng)藥殘留的分析方法有氣相色譜法[4-5]、氣質(zhì)聯(lián)用法[6-7]和液質(zhì)聯(lián)用法[8-12]。氣相色譜法分析時間長，選擇性差且易出現(xiàn)假陽性；液相色譜-質(zhì)譜法分析時間短，選擇性強(qiáng)，但是大部分脂溶性農(nóng)藥在液質(zhì)上響應(yīng)低或者無響應(yīng)，前處理的凈化方法主要有固相萃取凈化和分散固相萃取凈化，固相萃取凈化法存在有機(jī)試劑消耗量大、時間長、效率低、成本高等缺點(diǎn)。分散固相萃取凈化法[13-16]由于其簡單、可靠、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)在蔬菜水果農(nóng)藥多殘留的檢測中大量應(yīng)用，而在蜂蜜樣品多農(nóng)藥殘留前處理應(yīng)用的研究相對較少。本文通過對分散固相萃取凈化的前處理和儀器條件的優(yōu)化建立了可以快速檢測蜂蜜中112種農(nóng)藥殘留的方法，該方法具有操作簡單、分析時間短、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，為蜂蜜中多農(nóng)藥殘留分析提供了快速的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

蜂蜜樣品從超市購買。

Agilent 7890B/7000C氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、HP-5MS色譜柱(20 m×0.25 mm，0.25 μm，美國Agilent公司)；ST16R 離心機(jī)(美國賽默飛世爾公司)；BSA2202S電子天平(德國賽多利斯公司)；漩渦混合器(TALBOYS)；KQ5200E超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；Reeko AutoEVA-20全自動氮吹濃縮儀(杭州博?？苾x器有限公司)。

克百威、2,4-二甲基苯胺、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、特丁硫磷、樂果、δ-六六六、滅線磷等112種標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98.0%)購自德國DnEhrensmUerGmUH公司；內(nèi)標(biāo)外環(huán)氧七氯(純度99.5%)購自德國DnEhrensmUerGmUH公司；乙腈、丙酮、甲醇(色譜純)購自美國Merck公司；N-丙基乙二胺 (N-propylethylenediamine，PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、0.22 μm聚四氟乙烯濾膜購自天津博納艾杰爾科技有限公司；氯化鈉、無水硫酸鎂(分析純)購自廣州化學(xué)試劑廠，無水硫酸鎂使用前需在馬弗爐中550 ℃烘干4 h。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

HP-5MS色譜柱(20 m×0.25 mm×0.25 μm)與空心柱串聯(lián)(5 m×0.25 mm)，進(jìn)樣口溫度280 ℃，柱流量1.4 mL·min-1；采用程序升溫：起始柱溫80 ℃，保持0 min，以40 ℃·min-1升溫至160 ℃，保持0 min，再以20 ℃·min-1升溫至290 ℃保持1.5 min，總用時12.0 min；進(jìn)樣量2 μL，不分流進(jìn)樣，載氣為高純氦氣，碰撞氣為高純氬氣，純度≥99.999%。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電離方式為EI；色譜-質(zhì)譜接口溫度為280 ℃；電離能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；檢測器電壓為1 798 V；數(shù)據(jù)采集為多重反應(yīng)監(jiān)測；定量方式為內(nèi)標(biāo)法；112種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 112種農(nóng)藥的GC-MS/MS分析參數(shù)

表1(續(xù))

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取

稱取蜂蜜樣品(2.50±0.01)g于50 mL離心管中，加入8 mL一級水，2 500 r·min-1渦旋振蕩1 min，再加入15 mL乙腈，2 500 r·min-1渦旋振蕩1 min，超聲提取20 min后，加入5.0 g氯化鈉、2.00 g無水硫酸鎂，2 500 r·min-1渦旋振蕩1 min，8 000 r·min-1離心3 min，上清液待凈化。

1.3.2 凈化

取1.3.1待凈化液8 mL至15 mL離心管中，加入0.10 g C18、0.20 g PSA、0.50 g無水硫酸鎂，2 500 r·min-1渦旋振蕩1 min，8 000 r·min-1離心3 min，取出6.00 mL置于10 mL刻度管中，40 ℃氮吹至近干，準(zhǔn)確加入1.0 mg·L-1外環(huán)氧七氯100 μL，再準(zhǔn)確加入900 μL正己烷，2 200 r·min-1渦旋30 s，超聲30 s，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待上機(jī)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量各農(nóng)藥及內(nèi)標(biāo)外環(huán)氧七氯，用正己烷溶解，定容至50 mL容量瓶中，分別配制成500 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4 ℃冰箱避光保存；分別準(zhǔn)確移取0.50 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用正己烷稀釋定容于100 mL容量瓶中，配制成2.5 mg·L-1混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確移取0.50 mL內(nèi)標(biāo)儲備液稀釋到50 mL容量瓶中，得到5.0 mg·L-1內(nèi)標(biāo)中間液，于4 ℃冰箱避光保存。取蜂蜜空白樣品經(jīng)過1.3.1提取和1.3.2凈化后的基質(zhì)溶液配制0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.50 mg·L-1基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

蜂蜜樣品因其黏稠度大，直接加入試劑進(jìn)行提取效果較差，而蜂蜜的主要成分為果糖和葡萄糖等糖類，因此，可以加入純水進(jìn)行溶解稀釋來降低黏稠度，然后再加入提取劑進(jìn)行萃取，來改善提取效果，當(dāng)樣品量為2.50 g時，比較加入不同體積(4、6、8、10、12 mL)純水對提取回收率的影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)純水的加入體積為8 mL時，提取回收率已達(dá)到穩(wěn)定值，因此，加入純水的最佳體積為8 mL。當(dāng)蜂蜜的樣品量為2.50 g，加入純水體積為8 mL時，比較甲醇、乙腈、丙酮3種溶劑對蜂蜜樣品中112種農(nóng)藥組分提取的效果(加標(biāo)濃度為0.5 mg·kg-1，n=6)。當(dāng)采用甲醇提取時，由于極性較強(qiáng)，甲醇與水難以通過鹽析分層，提取回收率較差。而采用乙腈和丙酮提取時，農(nóng)藥組分有較好的溶解性，加入氯化鈉和無水硫酸鎂后，丙酮、乙腈與水容易分層，提取回收率比較理想，分別達(dá)到了82.1%～103%和81.6%～105%。但是丙酮為易制毒試劑，采購領(lǐng)用等程序比較繁瑣，因此，選取乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 提取劑體積的優(yōu)化

當(dāng)蜂蜜的樣品量為2.50 g，加入純水體積為8 mL時，比較不同體積(6、10、12、15、20 mL)乙腈的提取效果(加標(biāo)濃度為0.5 mg·kg-1，n=6)，以回收率作為考察指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果表明，回收率隨著提取體積的增加而升高，當(dāng)體積增加到15 mL時，回收率已達(dá)到穩(wěn)定，為了避免有機(jī)試劑的浪費(fèi)以及可能對環(huán)境造成的污染，選擇乙腈的提取體積為15 mL。

2.1.3 提取時間的優(yōu)化

提取溶劑和體積確定了以后，需要對提取時間進(jìn)行優(yōu)化，本研究比較不同超聲時間(10、15、20、25、30 min)的提取效果(加標(biāo)濃度為0.5 mg·kg-1，n=6)，以提取回收率作為考察指標(biāo)，結(jié)果表明，提取回收率隨著超聲時間的增加而升高，當(dāng)超聲時間達(dá)到20 min之后，回收率無明顯的提高，因此，最佳的超聲時間為20 min。

2.1.4 凈化方法的選擇和優(yōu)化

蜂蜜樣品經(jīng)過水-乙腈提取鹽析分層，農(nóng)藥組分被分配到乙腈層中，而部分糖類和大部分有機(jī)色素也會溶解在乙腈層，這些物質(zhì)的存在會對上機(jī)測定產(chǎn)生干擾，進(jìn)而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，需要對提取液進(jìn)行凈化，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。農(nóng)藥殘留常用的凈化方法為固相萃取凈化和分散固相萃取凈化，固相萃取凈化成本高、效率低、有機(jī)試劑消耗量大，與固相萃取凈化相比，分散固相萃取凈化簡單、可靠、快速、經(jīng)濟(jì)，常用的凈化劑為PSA、C18和無水硫酸鎂。其中無水硫酸鎂的作用主要是除去提取液的水分，經(jīng)過試驗(yàn)比較，0.5 g可以將水分去除。而PSA和C18可以去除糖類和色素等物質(zhì)，本研究比較了PSA、C18不同用量組合對凈化效果和回收率的影響，結(jié)果表明，當(dāng)0.1 g C18和0.2 g PSA組合時的回收率最好，凈化粉用量過低時，雜質(zhì)去除效果較差；凈化粉用量過高時，部分農(nóng)藥組分被PSA吸附，導(dǎo)致回收率低。因此，采用0.1 g C18、0.2 g PSA和0.5 g無水硫酸鎂組合凈化。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電子轟擊離子源(EI)電離模式下對112種農(nóng)藥組分進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描(Q1 Scan)，分別找到各個化合物的母離子，在3～45 eV進(jìn)行碰撞能量的優(yōu)化，對選定的母離子峰進(jìn)行子離子掃描，根據(jù)子離子掃描質(zhì)譜圖，選擇離子強(qiáng)度最大的為定量離子，離子強(qiáng)度次之的為定性離子。112種農(nóng)藥化合物優(yōu)化后的離子對和碰撞能量參數(shù)見表1。

2.2.2 氣相條件的優(yōu)化

通常情況下，氣相色譜-質(zhì)譜完成112種農(nóng)藥組分的分離需要80 min以上，本研究采用三重四級桿質(zhì)譜的多重反應(yīng)監(jiān)測模式，在該模式下，離子對掃描具有高選擇性和特異性，采用HP-5MS色譜柱(20 m×0.25 mm×0.25 μm)，分離結(jié)合升溫程序的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了12 min內(nèi)完成112種農(nóng)藥分析，同時為了避免色譜柱進(jìn)口端的污染，在色譜柱進(jìn)口端與空心柱串聯(lián)(5 m×0.25 mm)，而不影響分析時間。

2.3 方法的線性范圍、檢出限及定量限

檢出限和定量限通過空白樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)獲得，進(jìn)樣分析信噪比(≥3)和(≥10)對應(yīng)的樣品中濃度。經(jīng)過試驗(yàn)條件優(yōu)化，112種農(nóng)藥組分的檢出限為0.002 mg·kg-1，定量限為0.005 mg·kg-1。對0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.500 mg·kg-1系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)溶液進(jìn)樣分析，進(jìn)行線性擬合，相關(guān)系數(shù)均>0.995，112種農(nóng)藥組分在0.005～0.500 mg·kg-1線性關(guān)系良好。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

方法的準(zhǔn)確度通過空白蜂蜜樣品添加回收率來分析，精密度通過同一濃度添加6次回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差獲得，添加濃度選擇高中低(0.450、0.050、0.005 mg·kg-1)3檔濃度，從表2可以看出，本方法回收率和精密度符合GB/T 27404—2008食品理化分析方法確認(rèn)的要求。

2.5 樣品基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)指待測目標(biāo)物的樣品提取物，會增強(qiáng)或抑制被測目標(biāo)物的檢測響應(yīng)，從而對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度造成影響，氣相色譜-質(zhì)譜方法的建立需要考慮基質(zhì)效應(yīng)對準(zhǔn)確度的影響。本研究采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合內(nèi)標(biāo)法定量來消除蜂蜜基質(zhì)效應(yīng)對定量分析的影響，112種農(nóng)藥組分的空白添加回收率在68.4%～102%，說明該方法可以有效地消除蜂蜜樣品的基質(zhì)效應(yīng)，適應(yīng)于蜂蜜樣品中112種農(nóng)藥殘留的測定。

表2 蜂蜜回收率和精密度(n=6)

3 小結(jié)與討論

本研究通過對樣品前處理和儀器條件的優(yōu)化建立了分散固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法同時檢測蜂蜜中112種農(nóng)藥殘留的方法，該方法操作簡單，色譜分離采用HP-5MS色譜柱(20 m×0.25 mm×0.25 μm)與空心柱(5 m×0.25 mm)串聯(lián)，12 min內(nèi)完成112種農(nóng)藥分析，進(jìn)樣時間短，多重反應(yīng)監(jiān)測內(nèi)標(biāo)法定量，抗干擾能力強(qiáng)，靈敏度和準(zhǔn)確度高，為蜂蜜中多農(nóng)藥殘留分析提供快速的檢測方法。