流蘇多倍體誘導試驗初報

李承秀， 程甜甜， 燕語， 孫忠奎， 喬謙,3， 于永暢,4， 張林*

(1.泰安市泰山林業(yè)科學研究院，山東 泰安 271000； 2.泰安時代園林科技開發(fā)有限公司，山東 泰安 271000；3.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000； 4.泰山學院，山東 泰安 271000)

流蘇(Chionanthusretusus)為木犀科流蘇屬落葉喬木，又名糯米條、糯米茶，樹形高大優(yōu)美，枝葉茂盛，初夏滿樹白花，如覆霜蓋雪，清麗宜人，秋季滿樹金黃，別有一番景致，適宜在園林綠地觀賞，同時具有入藥和制茶等多種價值，也常作為嫁接桂花的砧木[1-3]。流蘇是我國珍貴的鄉(xiāng)土樹種，為國家二級保護植物，在我國生態(tài)地理分布廣，主產黃河中下游及以南地區(qū)，遍布甘肅、陜西、山西、河北、山東、河南、云南、四川、廣東、福建、臺灣等地[1,4-6]，潛在種質資源豐富，自然變異類型多，但目前開展的現代育種工作較少，選育的園藝品種較少，主要有春雪[7]、扭葉流蘇[8]，以及產于臺灣的變種齒葉流蘇[9]。由此可見，加強種質資源創(chuàng)制與新品種培育對于流蘇相關研究與產業(yè)發(fā)展尤為迫切。

多倍體育種受到廣大育種家的重視，多倍化可以增強植物的適應性和競爭力，表現出粗大、健壯、抗逆性強等特性。1937年秋水仙素誘導植物多倍體之后，有關多倍體誘導成功的報道層出不窮[10-11]，在蔬菜、作物、果樹、花卉[12-15]中應用較廣，也逐步應用到楊樹、橡膠樹、桑樹等林木倍性育種工作中[10]，但在園林綠化樹種中應用較少，尚未見到關于流蘇多倍體育種的研究報道。因此，本研究以前期紫薇[16]、青檀[17]等樹種的多倍體育種研究為基礎，開展流蘇多倍體育種試驗，以期獲得流蘇的優(yōu)異種質資源，拓寬培育流蘇新品種的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2015—2017年在泰山林業(yè)科學研究院溫室內進行。供試材料來自泰安市鄉(xiāng)土觀賞樹種國家林木種質資源庫的流蘇L-7單株種子。

1.2 方法

1.2.1 多倍體誘導

試驗采用化學誘變與負壓相結合的形式。將上年秋季收集的流蘇種子沙藏，于翌年春季挑取剛露芽的幼苗，將其置于裝有秋水仙素的培養(yǎng)皿中，并將培養(yǎng)皿置于負壓泵內，在95 kPa負壓條件下處理一定時間，處理結束后種植于50孔的穴盤中，待幼苗長到4～5片葉時移栽上盆。秋水仙素濃度設為0.2%、0.6%、1.0%、1.4%，負壓時間設為5、10、15 min，每處理100株，重復3次。

1.2.2 多倍體鑒定

參照青檀多倍體鑒定方法[17]。摘取待測流蘇葉片，采用流式細胞儀對樣品染色體倍性進行鑒定，采用常規(guī)莖尖壓片法對二倍體及疑似四倍體流蘇幼苗莖尖染色體數目進行鑒定，在ZEISS光學顯微鏡下觀察并成像。

1.3 統(tǒng)計

統(tǒng)計幼苗死亡數與形態(tài)變異株數，以未處理為對照，將葉片粗糙、變厚、葉色加深、植物矮小[14,17]視為變異植株。試驗數據采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 秋水仙素對流蘇幼苗的誘導效果

不同濃度秋水仙素和負壓時間處理對流蘇的成活率和形態(tài)變異率產生不同程度的影響。表1顯示，0.2%秋水仙素濃度處理的死亡率與對照間無顯著差異，隨著濃度的升高，死亡率明顯升高，濃度大于1.0%時各處理的死亡率相比對照均呈顯著性差異，其中，1.4%濃度、負壓15 min處理下的死亡率達到最高。

與死亡率的規(guī)律不同，形態(tài)變異率呈現先升高后降低的趨勢。在1.0%濃度、負壓10 min處理下達到最高值，隨著濃度的升高，變異率降至與對照相同的水平。

就負壓時間來看，在相同秋水仙素濃度處理下，死亡率與負壓時間未表現出明顯的變化關系，而10 min負壓處理時的形態(tài)變異率最大。綜合考慮認為，流蘇多倍體誘導應以0.6%～1.0%濃度的秋水仙素及負壓10 min為宜。

表1 不同秋水仙素濃度和負壓時間對流蘇 幼苗的誘導效果

2.2 變異植株DNA含量和細胞染色體數目的鑒定

采用流式細胞儀對二倍體流蘇植株和疑似四倍體的植株進行細胞DNA含量檢測。

圖1顯示，二倍體植株在相對熒光強度為40時達最高峰，疑似四倍體植株在相對熒光強度為80時具有最高峰，表明其細胞中DNA含量較普通二倍體增加1倍，由此可初步判定該植株為四倍體流蘇。

圖1 不同倍性流蘇流式細胞儀鑒定

為進一步確定疑似四倍體植株的倍性，采用常規(guī)壓片法對流蘇普通二倍體植株和誘導產生的疑似四倍體植株進行莖尖染色體檢測(圖2)。經染色體計數鑒定，普通二倍體植株染色體數目為2n=2x=46，疑似四倍體植株為2n=4x=92。通過2種方法，從109株形態(tài)變異植株中鑒定出4個四倍體植株，其余均為二倍體，四倍體變異成功率僅3.67%。

圖2 不同倍性流蘇莖尖染色體觀察

2.3 變異植株形態(tài)特征差異

將誘導產生的四倍體流蘇與普通二倍體流蘇同時移栽至保護地種植。圖3顯示，兩者在外部形態(tài)上具有明顯差異。四倍體植株整體表現為植株高大、葉片變厚、葉色加深、莖稈粗壯等特點。同一葉位，四倍體植株的葉片明顯大于二倍體植株，葉色明顯變深，葉片也明顯變厚，革質化程度高。二年生植株的同一位置上，四倍體植株莖粗為1.1 cm，而二倍體植株僅0.5 cm；四倍體植株的芽鱗明顯膨大，皮孔較二倍體變得大而稀疏。

圖3 不同倍性流蘇形態(tài)特征

3 小結與討論

大量研究表明，利用秋水仙素可成功誘導多倍體的產生，且已廣泛應用于植物新品種培育中，尤其是農作物的倍性育種中，也是林木與花卉新種質創(chuàng)制的重要手段，如紅掌、彩色馬蹄蓮、非洲菊、楊樹、桑樹、橡膠、刺槐、榿木、樺木、相思、枸杞、杜仲等[10-11,15,18-19]。本課題組前期采用秋水仙素處理青檀[16]、紫薇[17]也均成功獲得多倍體植株。目前，秋水仙素人工誘導多倍體多采用莖尖連續(xù)點藥的方法[20-21]，表明此法較大程度降低了幼苗成活率，且需連續(xù)多次點藥，費時費工?；谇捌诠ぷ鞯慕涷?，本試驗采用化學誘變與負壓相結合的方法處理流蘇幼苗，結果表明，可有效降低幼苗死亡率，流蘇死亡率最高僅為12%，且時間短，僅需10 min負壓即可有效獲得變異植株。可推廣應用于植物倍性育種工作中，尤其適用于野生珍稀瀕危植物的種質創(chuàng)制。

本試驗也存在不足之處。通過對變異率的計算認為，秋水仙素適宜濃度為0.6%～1.0%，需對施藥區(qū)間進一步細化，探索最佳濃度。同時，本試驗所得最高變異率(6.67%)遠低于紫薇(40%)[16]、青檀(34.2%)[17]、茶樹(40%)[22]、山楊(33.3%)[23]等林木普通點藥處理，與香樟(12%)[24]、皺皮木瓜(9.09%)[25]、棗樹(4.33%)[26]等相當，物種類別與施藥方法是否為導致差異之大的主導因素還需深入探究，并提出相應的解決措施，從而提升此方法誘導多倍體的成功率。

與普通二倍體相比，多倍體常具有巨大性的特點，如莖稈粗壯，葉片、果實、種子等比較大。本試驗所得四倍體流蘇也具有巨大性特點，同時期四倍體流蘇植株在外部形態(tài)上明顯大于二倍體植株，且長勢旺。據Frary等[27-28]報道，一些基因具有等位劑量效應，這些基因的高水平表達會導致植物葉、花、果的增大，四倍體流蘇的巨大性可能與其內部某些基因的高水平表達有關，具體還需進一步研究確定。同時，四倍體常表現出優(yōu)于二倍體的抗逆性。流蘇作為一種珍貴的鄉(xiāng)土樹種，常應用于荒山造林中，若四倍體流蘇能體現出更強的抗逆性，可極大的提高造林成活率與綠化率，降低造林成本，對四倍體流蘇的生長發(fā)育、生理特性、抗逆性等展開全面細致的研究將是下一步的工作方向。