氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中嘧菌酯殘留量的不確定度評定

陳秀寬 顧靜 梁少東 張銓

摘 要：目的：評定氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中嘧菌酯殘留量的不確定度。方法：建立不確定度評定的數(shù)學(xué)模型，對測量結(jié)果的每個(gè)不確定度來源進(jìn)行分析和評定。結(jié)果：茶葉中嘧菌酯殘留量為0.100 mg/kg，其擴(kuò)展不確定度為0.005 mg/kg（P=95%，k=2）。結(jié)論：加標(biāo)回收率和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的不確定度分量是影響嘧菌酯殘留量不確定度的主要來源。

關(guān)鍵詞：氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;嘧菌酯;不確定度;茶葉

Uncertainty Evaluation for the Determination of Azoxystrobin Residues in Tea by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Xiukuan， GU Jing， LIANG Shaodong*， ZHANG Quan

（Beihai Food and Drug Inspection Institute， Beihai 536000， China）

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty for the determination of azoxystrobin residues in tea by gas chromatography-tandem mass spectrometry（GC-MS/MS）. Methods： A mathematical model was established，and each component of uncertainty was calculated and evaluated. Results： When the azoxystrobin residues content in tea was 0.100 mg/kg， the expanded uncertainty was 0.005 mg/kg（P=95%，k=2）. Conclusion： The recovery of standard addition and the uncertainty components introduced by the preparation of standard working solutions are the main sources of uncertainty of residual azoxystrobin.

Keywords： Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry ; azoxystrobin; uncertainty; tea

嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸類殺菌劑，因其具有高效、低毒的特點(diǎn)，其使用量在全球逐漸增長[1-2]，且在我國茶葉種植中也有使用。日本肯定列表制度中嘧菌酯在茶葉中的最大允許殘留量為10 mg/kg，歐盟在茶葉中嘧菌酯的最大允許殘留量則更為嚴(yán)格，為0.1 mg/kg。而我國現(xiàn)行國標(biāo)中，對茶葉中嘧菌酯的最大允許殘留量卻沒有規(guī)定[3]。目前我國氣質(zhì)聯(lián)用法檢測茶葉的現(xiàn)行國標(biāo)中[4-5]，其檢測的農(nóng)藥并不包括嘧菌酯。因此，參照國標(biāo)《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》（GB 23200.113—2018）、《測定不確定度的評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[6]和《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》CNAS—CL006：2019[7]，建立了一種利用QuEChERS凈化技術(shù)，快速測定茶葉中嘧菌酯的方法，并對其進(jìn)行不確定度評定，為評價(jià)測量結(jié)果的可靠性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用茶葉均于本地超市隨機(jī)購買。

1.2 試劑

乙腈，購自美國Fiher公司;乙酸，購自上海安譜公司;嘧菌酯（100 mg/L，1.2 mL）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購自壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司;水為娃哈哈純凈水。

1.3 儀器

TQ-8040NX氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司;XSE205電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司;Thermo scientific ST40R高速冷凍離心機(jī)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 mg/L，1.2 mL）1.0 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。取適量嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)中間液，用空白基質(zhì)溶液稀釋，配制成0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L和0.20 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液?；|(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.2 樣品處理

稱取2.00 g試樣于50 mL塑料離心管中，加10 mL水渦旋混勻，靜置10 min。加入10 mL乙腈-乙酸（99∶1），6 g無水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩1 min，4 200 r/min離心5 min。

吸取8 mL上清液加到含1.2 g硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18及400 mg GCB的塑料離心管中，渦旋混勻1 min。4 200 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，上氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測試。

1.4.3 儀器條件

（1）色譜條件。SH-Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;進(jìn)樣口溫度280 ℃;載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min;恒流模式;不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量1 μL;色譜柱溫度：初始溫度100 ℃，以30 ℃/min升至200 ℃，10 ℃/min升至300 ℃，保持10 min。

（2）質(zhì)譜條件。將嘧菌酯進(jìn)行全掃描，確定母離子，再給予一定的碰撞能量，掃描二級子離子，選取豐度較高的2個(gè)子離子分別為定量離子對和定性離子對，最后以MRM模式優(yōu)化最佳碰撞能量。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間：嘧菌酯的定量離子對344.1→329.1，碰撞電壓16 V，定性離子對344.1→171.1，碰撞電壓40 V，保留時(shí)間15.625 min。

1.4.4 數(shù)學(xué)模型的建立

嘧菌酯含量計(jì)算公式為：

（1）

式中：X為試樣中被測物殘留量，mg/kg;C為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中被測物的濃度，mg/L;V為定容體積，mL;m為試樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的來源分析

根據(jù)數(shù)學(xué)模型，確定不確定度來源為樣品測定重復(fù)性引入的不確定度和樣品加標(biāo)回收引入的不確定度（A類評定）;樣品稱量引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度引入的不確定度（包括標(biāo)準(zhǔn)溶液純度、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程、不同量程的移液器引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度）、前處理提取溶液體積引入的不確定度（B類評定）。由于溫度影響和溶劑膨脹系數(shù)的數(shù)值很小，其引入的不確定度對結(jié)果評定不影響，故不考慮溫度因素和溶劑膨脹系數(shù)因素引入的不確定度。

2.2 不確定度分量的評定與計(jì)算

2.2.1 A類不確定度的評定

（1）樣品測定重復(fù)性引入的不確定度Urel（R1）。在重復(fù)性測定條件下，對加標(biāo)樣品（0.1 mg/kg）平行測定6次，嘧菌酯的加標(biāo)回收結(jié)果為0.091 0 mg/kg、0.089 9 mg/kg、0.093 0 mg/kg、0.089 5 mg/kg、0.089 0 mg/kg和0.092 3 mg/kg，平均值為0.091 mg/kg，按照貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.160 4%，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

Urel

（2）樣品加標(biāo)回收引入的不確定度Urel（R2）。按照歐盟嘧菌酯最大允許殘留量，在6份茶葉樣品中添加0.1 mg/kg嘧菌酯，嘧菌酯的回收率分別為90.80%、89.40%、96.10%、89.50%、88.45%和91.75%，平均回收率為91.0%，測得嘧菌酯平均含量為0.091 mg/kg。

按照貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.75%。標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

用t分布來檢驗(yàn)平均回收率是否與1.0有顯著性差異，經(jīng)查表得知，在95%置信度，n=6，臨界值為2.57。如果平均回收率≥2.57，則說明有顯著差異。反之，則沒有顯著差異。檢測統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，得到。t值結(jié)果大于2.57，平均回收率與1.0有顯著差異，故需要按平均回收率修正結(jié)果，修正后嘧菌酯含量為0.100 mg/kg。

綜合所有A類各個(gè)分量分析評定，合成A類相對不確定度為：

2.2.2 B類不確定度評定

（1）樣品稱量引入的不確定度 Urel（m）

天平校準(zhǔn)證書規(guī)定，精密為0.000 1 g天平最大允許誤差為±0.5 mg，按均勻分布估算，。由樣品稱量引入的相對不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度引入的不確定度Urel（C）

（a）標(biāo)準(zhǔn)溶液純度引入的不確定度Urel（Ca）。根據(jù)使用的嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）證書得知，其擴(kuò)展不確定度為3%，k=2。則。

（b）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程引入的不確定度Urel（Cb）。標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）由標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）稀釋10倍配制，即準(zhǔn)確吸取1.0 mL儲備液于10 mL容量瓶，乙腈定容到刻度。依據(jù)JJG 196—2006[8]，1 mL單標(biāo)線A級吸量管容量誤差為±0.007 mL，以均勻分布估算，其引入的相對不確定度為：

依據(jù)JJG 196—2006，10 mL A級容量瓶容量誤差為±0.020 mL，以均勻分布估算，其引入的不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的相對不確定度為：

（c）使用不同量程的移液器引入的不確定度Urel（Cc）。

使用上述標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）配制嘧菌酯濃度為0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL和0.20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。使用移液器為200 μL、100 μL、20 μL移液槍，容量瓶10 mL。根據(jù)移液槍檢定證書，不同檢定點(diǎn)的允許誤差，按照均勻分布估算，計(jì)算出移液器不同吸取體積的不確定度，見表2。

其中，10 mL容量瓶使用了5次，200 μL移液槍200 μL量程，100μL量程各使用了一次，100 μL移液槍100 μL量程使用了1次，20 μL移液槍20 μL量程，10 μL量程各使用了1次，2次。因此，使用不同量程的移液器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（d）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度Urel（Cd）。對5個(gè)濃度水平嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)工作液，用最小二乘法進(jìn)行擬合。用擬合后的校準(zhǔn)曲線，對加標(biāo)樣品平行測定6次，結(jié)果見表3。因此由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對不確定度見式（2）：

（2）

式中：Urel（Cd）為曲線擬合引入的相對不確定度;S（A）為擬合曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差;b為曲線斜率;p為樣品測定次數(shù)，p=6;n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)，n=5;

C為標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，μg/mL;C0為待測樣品濃度平均值，0.018 2 mg/L;C為標(biāo)準(zhǔn)系列濃度平均值，0.076 mg/L。其中S（A）可按公式（3）計(jì)算：

（3）

式中：S（A）為擬合曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差;n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)，n=5;A為標(biāo)準(zhǔn)溶液儀器理論響應(yīng)值;Ai為標(biāo)準(zhǔn)溶液儀器實(shí)際響應(yīng)值。

由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度由公式2計(jì)算，Urel（Cd）=0.003 4。

綜上所述，由標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的相對不確定度為：

（3）前處理提取溶液體積引入的不確定度Urel（V）

提取液10 mL，用10 mL單標(biāo)線吸量管（A級）移取，根據(jù)JJG 196—2006，10 mL單標(biāo)線A級吸量管容量誤差為±0.02 mL，以均勻分布估算，其引入的相對不確定度為：

綜上所有B類各個(gè)分量的分析評定，合成B類相對不確定度為：

2.3 合成不確定度

將A類評定Urel（A）和B類評定Urel（B）進(jìn)行合成，即得茶葉中嘧菌酯測定的相對合成不確定度為：

2.4 擴(kuò)展不確定度的合成

假設(shè)測量結(jié)果符合正態(tài)分布，在置信區(qū)間為95%時(shí)，選擇包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度為

2.5 測量結(jié)果不確定度的表示

根據(jù)JJF 1059.1—2012的規(guī)定，茶葉中嘧菌酯的含量結(jié)果為（0.100±0.005）mg/kg，k=2。

3 結(jié)論

通過評定可知，測量結(jié)果不確定度最大的來源為加標(biāo)回收率和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的不確定度。因此，在試驗(yàn)過程中，盡可能減少提取凈化步驟，提高樣品回收率，使用更高純度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和精密度更高的移液用具，可減少不確定度的引入，使結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。

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通信作者：梁少東（1982—），男，廣西北海人，本科，工程師。研究方向：食品安全分析。E-mail：34697171@qq.com。