姜黃素通過AKT/HIF-1α/VEGF信號通路在體外抑制脈絡(luò)膜新生血管的機(jī)制

陳水齡,亢澤峰,褚文麗,郝雪蓮,陶方方,張明明,李書嬌

0引言

脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是年齡相關(guān)性黃斑病變(age-related macular degeneration，ARMD)、病理性近視(pathological myopia，PM)及中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變(central exudative choroidal retinopathy，CEC)等多種眼底疾病的病理表現(xiàn)。CNV的形成是多細(xì)胞與多因子共同作用的結(jié)果，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知促進(jìn)CNV形成的重要的因子之一。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)相關(guān)信號通路是參與調(diào)控這些細(xì)胞與因子活性的重要信號通路[1]。目前，中藥單體在抗新生血管方面的研究較多，尤其是在抗腫瘤新生血管方面，也為眼科新生血管類疾病的研究提供了思路。姜黃素(Curcumin)是從姜科植物姜黃、郁金、莪術(shù)提取的一種多酚類化合物，也是姜黃發(fā)揮藥理作用的主要成分，體內(nèi)外實驗研究證實其藥理作用廣泛[2-3]，主要有抗炎、抗氧化、抗新生血管及抗腫瘤等[4-5]，但在CNV方面的研究較少。本研究探討姜黃素在體外抑制CNV的作用機(jī)制，為CNV的治療提供思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來源人視網(wǎng)膜色素上皮(ARPE-19)細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購自美國ScienCell公司。

1.1.2主要試劑氯化鈷(CoCl2)和姜黃素(美國Sigma)，DMEM/F12培養(yǎng)液(美國Hyclon)，ECM培養(yǎng)基(美國Cell Signaling Technology)，胎牛血清(美國Gibco)，Matrigel基質(zhì)膠(美國BD)，CCK-8試劑盒(日本同仁)。RNA試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。一抗：anti-AKT和anti-p-AKT(美國CST)，anti-HIF-1α和anti-VEGF-A(美國Abcam)。

1.2方法

1.2.1CCK-8法篩選造模試劑CoCl2和實驗藥物姜黃素及陽性對照藥雷珠單抗的濃度將對數(shù)生長期ARPE-19細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24h；分別加入濃度為0、50、100、200、400及800μmol/L的CoCl2溶液分別培養(yǎng)6、12、24和48h后，每孔加入CCK-8溶液20μL，培養(yǎng)4h后檢測各孔在450nm的吸光度值(OD值)。以正常組細(xì)胞活性為1，各實驗組細(xì)胞活性=(實驗組平均OD值-空白孔平均OD值)/(正常組平均OD值-空白孔平均OD值)，每組3個復(fù)孔。同樣的方法加入濃度為0、6.25、12.5、25、50、100及200μmol/L姜黃素分別培養(yǎng)6、12、24和48h；濃度為0、5、10、20、40和80μg/mL雷珠單抗培養(yǎng)24h。

1.2.2CCK-8法檢測各實驗組ARPE-19細(xì)胞的活性將對數(shù)生長期ARPE-19細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)24h，根據(jù)分組給予不同干預(yù)，正常組：ARPE-19；模型組：ARPE-19+CoCl2；雷珠單抗組：ARPE-19+CoCl2+雷珠單抗；姜黃素低劑量組：ARPE-19+CoCl2+姜黃素低劑量；姜黃素中劑量組：ARPE-19+CoCl2+姜黃素中劑量；姜黃素高劑量組：ARPE-19+CoCl2+姜黃素高劑量組。培養(yǎng)24h后加入CCK-8溶液20μL，培養(yǎng)4h后檢測各孔在450nm的吸光度值(OD值)。以正常組細(xì)胞活性為1，各實驗組細(xì)胞活性=(實驗組平均OD值-空白孔平均OD值)/(正常組平均OD值-空白孔平均OD值)。

1.2.3RT-qPCR檢測各組細(xì)胞AKT和HIF-1α及VEGFmRNA的表達(dá)制備各組ARPE-19細(xì)胞樣本，按照Trizol說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qPCR設(shè)置反應(yīng)條件：95℃×10min→95℃×15s→60℃×1min，35～40個循環(huán)，進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，得到目的基因表達(dá)的相對定量值，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。其中引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計與合成，具體序列如下：GAPDH-F：GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA，GAPDH-R：GACTCATCGTACTCCTGCTTGCT，AKT-F：ACTGTCATCGAACGCACCTT，AKT-R：CTCCTCCTCCTCCTGCTTCT，HIF-1α-F：ACCTATGACCTGCTTGGTG，HIF-1α-R：GGCTGTGTCGACTGAGGAA，VEGF-F：GAGTACATCTTCAAGCCATCCT，VEGF-R：TGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGC。

1.2.4Westernblot檢測各組細(xì)胞AKT、p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)采用Western blot法檢測CoCl2(100μmol/L)對ARPE-19細(xì)胞AKT、p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)的影響。制備細(xì)胞樣本，提取總蛋白，BCA法計算蛋白濃度，制備蛋白SDS-PAGE膠，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))，抗體孵育(其中一抗稀釋比例為AKT 1∶1000，p-AKT 1∶2000，HIF-1α 1∶500，VEGF 1∶1000)，曝光顯影，測定條帶灰度值，以β-actin條帶的光密度值校正，得到目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5CCK-8法檢測缺氧條件下ARPE-19細(xì)胞姜黃素條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞活性的影響根據(jù)1.2.2制備缺氧條件下ARPE-19細(xì)胞不同組條件培養(yǎng)液，CCK-8法檢測各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞活性的影響(具體方法同1.2.1)。

1.2.6細(xì)胞劃痕實驗檢測各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞水平遷移的影響待HUVEC細(xì)胞生長至80%融合時，調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升1×105個，接種于24孔板中待細(xì)胞生長融合成單層細(xì)胞后，用10μL微量加樣槍頭垂直于板底行“一”字形劃痕，PBS沖洗，鏡下拍攝0h和不同條件培養(yǎng)液干預(yù)24h后的照片(40×)，重復(fù)3次。測量并計算各組遷移率，遷移率=(S0-St)/S0×100%(S0：原始裸區(qū)面積，St：各時間點裸區(qū)面積)。

1.2.7Transwell小室法檢測各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞垂直遷移和侵襲的影響Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲的不同在于侵襲實驗需要加入Matrigel基質(zhì)膠。調(diào)整HUVEC細(xì)胞至每毫升1×105個，在Transwell的下室，根據(jù)分組給予不同條件培養(yǎng)液；在Transwell的上室加入HUVEC細(xì)胞懸液。加樣后培養(yǎng)24h，吸盡小室內(nèi)液體，擦去小室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，晾干。倒置顯微鏡下取上下左右中間5個視野拍照(100×)，相對垂直遷移率=實驗組/正常組，相對侵襲率=實驗組/正常組。

1.2.8Matrigel基質(zhì)膠法檢測各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞管腔形成的影響96孔板中用預(yù)冷的槍頭在每孔加入Matrigel基質(zhì)膠培養(yǎng)2h，使膠凝固。同時消化HUVEC細(xì)胞，調(diào)整至每毫升2×105個，根據(jù)分組給予不同條件培養(yǎng)液和HUVEC細(xì)胞懸液，接種于96孔板中培養(yǎng)6h。倒置顯微鏡下取上下左右中間5個不同視野進(jìn)行拍照(100×)，相對管腔形成率=實驗組/正常組。

統(tǒng)計學(xué)分析：采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度CoCl2對ARPE-19細(xì)胞活性的影響隨著濃度的增加，細(xì)胞活性呈現(xiàn)先增長后抑制，當(dāng)CoCl2濃度≥200μmol/L時，ARPE-19細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，鏡下可見細(xì)胞皺縮稀疏。因此，我們選擇CoCl2濃度為100μmol/L，干預(yù)24h進(jìn)行后續(xù)實驗研究，見表1。

表1 不同濃度CoCl2對ARPE-19細(xì)胞活性的影響

2.2不同濃度姜黃素對ARPE-19細(xì)胞活性的影響姜黃素濃度在0～100μmol/L時，對細(xì)胞活性沒有影響，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)未見變化。當(dāng)濃度為200μmol/L時，細(xì)胞活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，鏡下觀察細(xì)胞皺縮，數(shù)量減少。因此，我們選擇姜黃素濃度為6.25、25、100μmol/L為低、中、高劑量進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實驗研究，見表2。

表2 不同濃度姜黃素對ARPE-19細(xì)胞活性的影響

2.3不同濃度雷珠單抗對CoCl2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞活性的影響當(dāng)雷珠單抗?jié)舛葹?0μg/mL時，ARPE-19細(xì)胞的活性較CoCl2組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)濃度>20μg/mL時，ARPE-19細(xì)胞的活性較CoCl2組和正常組均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此，我們選擇雷珠單抗?jié)舛葹?0μg/mL進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實驗研究，見表3。

表3 不同濃度雷珠單抗對CoCl2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞活性的影響

2.4各組間AKT和HIF-1α及VEGFmRNA相對表達(dá)量AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相對表達(dá)量模型組均高于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；雷珠單抗組均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；姜黃素低、中劑量與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；姜黃素高劑量組較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與雷珠單抗組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組間AKT和HIF-1α及VEGF mRNA相對表達(dá)量

2.5各組間AKT和HIF-1α及VEGF蛋白相對表達(dá)量各組間AKT蛋白比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白相對表達(dá)量模型組均高于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，雷珠單抗組均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。p-AKT和HIF-1α蛋白相對表達(dá)量姜黃素低、中劑量與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，姜黃素高劑量組較模型組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與雷珠單抗組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。VEGF蛋白相對表達(dá)量姜黃素低劑量組與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，姜黃素中、高劑量組較模型組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與雷珠單抗組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1，表5。

表5 各組間AKT和HIF-1α及VEGF蛋白相對表達(dá)量

圖1 各組間AKT和HIF-1α及VEGF蛋白相對表達(dá)量 A：正常組；B：模型組；C：雷珠單抗組；D：姜黃素低劑量組；E：姜黃素中劑量組；F：姜黃素高劑量組。

2.6ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞活性的影響ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞活性的影響比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表6。

2.7ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞水平遷移的影響ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞水平遷移的影響比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組相比模型組HUVEC細(xì)胞水平遷移顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比雷珠單抗組水平遷移較少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；姜黃素條件培養(yǎng)液低、中、高劑量組水平遷移較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中，高劑量組與雷珠單抗組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2，表6。

圖2 ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞水平遷移的影響 A：正常組；B：模型組；C：雷珠單抗組；D：姜黃素低劑量組；E：姜黃素中劑量組；F：姜黃素高劑量組。

2.8ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞垂直遷移的影響ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞垂直遷移的影響比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組相比模型組HUVEC細(xì)胞垂直遷移顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比雷珠單抗組垂直遷移較少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；姜黃素條件培養(yǎng)液低、中劑量組細(xì)胞垂直遷移與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，姜黃素條件培養(yǎng)液高劑量組垂直遷移較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與雷珠單抗組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3，表6。

圖3 ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞垂直遷移的影響 A：正常組；B：模型組；C：雷珠單抗組；D：姜黃素低劑量組；E：姜黃素中劑量組；F：姜黃素高劑量組。

2.9ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞侵襲的影響ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞侵襲的影響比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組相比模型組HUVEC細(xì)胞侵襲顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比雷珠單抗組侵襲顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；姜黃素條件培養(yǎng)液低、中劑量組細(xì)胞侵襲與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，姜黃素條件培養(yǎng)液高劑量組侵襲較模型組顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與雷珠單抗組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4，表6。

圖4 ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞侵襲的影響 A：正常組；B：模型組；C：雷珠單抗組；D：姜黃素低劑量組；E：姜黃素中劑量組；F：姜黃素高劑量組。

2.10ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞管腔形成的影響ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞管腔形成的影響比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較模型組HUVEC細(xì)胞管腔形成明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較雷珠單抗組管腔形成顯著較少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較姜黃素條件培養(yǎng)液低劑量組管腔形成未見明顯變化，中、高劑量組管腔形成顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中高劑量組管腔形成與雷珠單抗組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5,表6。

表6 ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞的影響

圖5 ARPE-19細(xì)胞各組條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞管腔形成的影響 A：正常組；B：模型組；C：雷珠單抗組；D：姜黃素低劑量組；E：姜黃素中劑量組；F：姜黃素高劑量組。

3討論

多種細(xì)胞成分參與了CNV的形成，其中RPE細(xì)胞是CNV的主要細(xì)胞成分之一，CNV病變早期就存在RPE細(xì)胞的萎縮或功能減退。RPE是視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和脈絡(luò)膜之間含有色素的單層細(xì)胞，它與視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層、Bruch 膜和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管共同組成光感受器細(xì)胞-RPE-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體，在視網(wǎng)膜生理病理中發(fā)揮重要作用[6]，與眼底新生血管性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。在缺氧狀態(tài)下，RPE 細(xì)胞異常分泌VEGF等促血管生長因子，Bruch膜損傷，CNV形成，視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞因缺乏脈絡(luò)膜的營養(yǎng)供應(yīng)而凋亡。內(nèi)皮細(xì)胞作為組織與血液的第一道屏障，也是最先感受缺氧的細(xì)胞之一。在CNV疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，RPE細(xì)胞缺氧、內(nèi)皮細(xì)胞受損及功能障礙是其中的關(guān)鍵因素，對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)可阻止其進(jìn)一步惡化，達(dá)到治療疾病的目的。

缺氧誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)是CNV發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。HIF-1α是細(xì)胞內(nèi)氧平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在缺氧誘導(dǎo)的血管生成、腫瘤發(fā)生、炎性反應(yīng)以及細(xì)胞自噬等方面都起關(guān)鍵作用，它的激活可作為組織和細(xì)胞缺氧的直接反映與重要標(biāo)志。本研究顯示，CoCl2在100μmol/L濃度時可以促進(jìn)細(xì)胞中HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)，這說明我們的ARPE-19細(xì)胞體外缺氧模型的建立是成功的，與以往文獻(xiàn)報道類似[9-10]，其機(jī)制與AKT信號通路有關(guān)。近年來大量的體內(nèi)外實驗研究證實姜黃素藥理作用廣泛[2,11]，主要有抗炎、抗氧化、抗新生血管[3,5]及抗腫瘤等[12-13]，且無明顯毒副作用。姜黃素在眼科相關(guān)的研究較多，包括抑制角膜新生血管形成[13]；抑制翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增生；抑制青光眼小梁切除術(shù)后濾過道瘢痕化；防治增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變[14-15]；抑制人[16]和動物[17-18]視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖[19]；延緩實驗動物早期[20]糖尿病視網(wǎng)膜病變[21]；減少[22-23]視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷[24]；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的保護(hù)[25-26]及治療眼部腫瘤等[27]多方面。

正常情況下，眼部組織中VEGF表達(dá)水平很低；但在缺血、缺氧、炎癥等應(yīng)激情況下[28-29]，VEGF的表達(dá)水平會顯著增高，繼而誘發(fā)新生血管形成。目前眼科臨床使用的各種抗VEGF類藥物通過抑制VEGF與受體結(jié)合從而抑制CNV生長及血管滲漏，改善或維持患者的視力。本研究顯示100μmol/L的姜黃素可減少ARPE-19細(xì)胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)，可見姜黃素對CoCl2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞缺氧具有保護(hù)作用，但需要達(dá)到一定劑量。體外血管形成實驗可分為細(xì)胞增殖實驗、水平遷移實驗[30-31]、垂直遷移實驗[32-35]，細(xì)胞侵襲實驗[36]，管腔形成實驗，以及器官水平的人胎盤血管段培養(yǎng)模型和大鼠動脈環(huán)模型。目前通常所說的血管形成實驗是指細(xì)胞的管腔形成實驗，它可從側(cè)面反映毛細(xì)血管的早期形成過程，是體外檢測內(nèi)皮細(xì)胞功能的指標(biāo)。血管形成過程中內(nèi)皮細(xì)胞會形成細(xì)胞條索，然后形成管腔。在特定條件下如基質(zhì)膠、膠原等培養(yǎng)時可見到管腔形成[37-38]。本研究顯示姜黃素條件培養(yǎng)液低、中、高劑量組可降低細(xì)胞水平遷移；中、高劑量組可減少細(xì)胞管腔形成；高劑量組還可降低細(xì)胞垂直遷移及降低細(xì)胞侵襲。

綜上所述，本研究結(jié)果表明姜黃素可在細(xì)胞水平抑制新生血管的形成，其機(jī)制可能與AKT/HIF-1α/VEGF信號通路有關(guān)。但鑒于姜黃素藥理作用復(fù)雜，且體外培養(yǎng)的細(xì)胞成分單一，其形態(tài)、功能和體內(nèi)均有一定的差別，因此，進(jìn)一步完善體內(nèi)實驗，證實其在抑制新生血管中的作用將為臨床應(yīng)用奠定堅實基礎(chǔ)。