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    MicroRNA-590和microRNA-196b在兒童IgA腎病診斷中的價值

    2022-03-31 01:12:28沈銀紅沈紅
    關(guān)鍵詞:局灶系膜腎小球

    沈銀紅,沈紅

    (青海省婦女兒童醫(yī)院 腎病科,青海 西寧810007)

    IgA 腎病是腎小球系膜區(qū)以IgA 或IgA 沉積為主,伴或不伴有其他免疫蛋白在腎小球系膜區(qū)沉積的原發(fā)性腎小球疾病,包括局灶節(jié)段性病變、毛細血管內(nèi)增生病變等。臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性血尿,伴有不同程度的尿蛋白,部分患兒可出現(xiàn)腎功能不全,易發(fā)展為終末期腎病,嚴重危害患兒生命健康[1-3]。臨床主要通過腎活檢病理診斷,光鏡下常見彌漫性系膜細胞增生或局灶階段增生性腎小球腎炎,但腎活檢術(shù)屬創(chuàng)傷性技術(shù),兒童接受度差,且少數(shù)患兒有腎活檢并發(fā)癥需手術(shù)止血或腎切除[4],因此有必要尋求IgA 腎病的無創(chuàng)性檢查的生物學(xué)標志物。研究[5-6]認為,IgA 腎病的發(fā)生與免疫功能低下及氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。microRNA 在免疫學(xué)中的研究日益增多,研究表明,microRNA-590(miR-590)異常低表達可誘發(fā)口舌鱗癌中細胞的免疫逃逸[7]。miR-590 可有效減輕急性腎損傷小鼠腎損傷程度[8], microRNA-196b(miR-196b) 也參與小鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷[9]。miR-590 和miR-196b 在IgA 腎病中的研究較少,因此本研究重點探討miR-590、miR-196b 在IgA 腎病中的表達及作用,為臨床IgA 腎病檢查提供新的生物標志物。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選取2017年6月—2019年5月青海省婦女兒童醫(yī)院經(jīng)腎活檢病理診斷為原發(fā)性IgA 腎病患兒83 例。其中,男性42 例,女性41 例;年齡3~16 歲,平均(8.52±1.23)歲;病程1 個月~1.5年,平均(0.72±0.16)年。納入標準:符合IgA 腎病診斷標準[10];腎活檢前3 個月未進行糖皮質(zhì)激素及(或)免疫抑制劑治療。排除標準:合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性紫癜、血液病等系統(tǒng)性疾病引起的繼發(fā)性IgA 腎??;腎活檢光鏡下腎小球數(shù)目<8;eGFR<10 mL/(min·1.73 m2)。選取非IgA 腎病患兒35 例,包括腎微小病變5 例、局灶節(jié)段性腎小球腎炎8 例、膜性腎病15 例、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥7 例。其中,男性19 例,女性16 例;年齡3~16 歲,平均(8.47±1.45)歲。另選取同期該院體檢健康兒童42例作為對照組。其中,男性18 例,女性24 例;年齡3~16 歲,平均(8.95±1.35)歲。3 組性別、年齡等一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    1.2 方法

    1.2.1 標本采集 所有受試者均采集肘靜脈血2 mL,3 000 r/min,20 min 離心,取上清液,置入-20℃冰箱冷凍保存待測。

    1.2.2 臨床指標 受試者年齡、性別、24 h 蛋白尿、血清白蛋白、血肌酐(Scr)。患兒血清IgA 水平采用免疫比濁法檢測。

    1.2.3 病理分級 根據(jù)Lee 氏分級[11]分為Ⅰ級7 例,Ⅱ級8 例,Ⅲ級25 例,Ⅳ級16 例,Ⅴ級27 例。Ⅰ級:腎小球絕大多數(shù)正常,偶見輕度系膜增寬,伴和(或)不伴細胞增生,腎小管和腎間質(zhì)無改變。Ⅱ級:腎小球有局灶系膜增殖和硬化(<50%),有小新月體,腎小管和腎間質(zhì)無損害。Ⅲ級:腎小球呈彌漫性系膜增值和增寬(偶爾局灶節(jié)段),偶見小新月體;腎小管和腎間質(zhì)改變則呈現(xiàn)出局灶性腎間質(zhì)水腫,偶見細胞浸潤,罕見腎小管萎縮;Ⅳ級:腎小球病變呈重度彌漫性系膜增生和硬化,部分或全部腎小球硬化,可見新月體(<45%)。腎小管萎縮,腎間質(zhì)浸潤,偶見腎間質(zhì)泡沫細胞;V級:腎小球新月體形成>45%;腎小管和腎間質(zhì)病變類似于Ⅳ級,但較Ⅳ級嚴重。

    1.2.4 qRT-PCR 法檢測血清miR-590、miR-196b相對表達量 按照Trizol 試劑盒操作說明書提取血清總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將2 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照SYBR Green RCR Master Mix 試劑說明書配制反應(yīng)體系并加樣。完成后將其放入熒光定量PCR 儀上進行反應(yīng),反應(yīng)條件為:95℃15 s,60℃15 s,72℃15 s,共40 個循環(huán)。miR-590、miR-196b 以U6為內(nèi)參基因,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù),采用2-ΔΔCt算法計算miR-590、miR-196b 相對表達量。

    表1 qRT-PCR引物序列

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,比較用方差分析,進一步兩兩比較用LSD-t檢驗;計數(shù)資料以構(gòu)成比或率(%)表示,比較用χ2檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 一般資料的比較

    3 組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);3組肌酐、白蛋白、24 h蛋白尿、血清IgA水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),IgA腎病組肌酐、24 h蛋白尿、血清IgA水平較對照組、非IgA腎病組升高(P<0.05),IgA腎病組白蛋白水平較對照組、非IgA腎病組下降(P<0.05)。見表2。

    表2 3組一般資料比較

    2.2 3 組受試者血清miR-590 mRNA、miR-196b mRNA相對表達量的比較

    3 組miR-590 mRNA、miR-196b mRNA 相 對表達量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),IgA 腎病組miR-590 mRNA 相對表達量較對照組、非IgA 腎病組下降(P<0.05),IgA 腎病組miR-196b mRNA 相對表達量較對照組、非IgA 腎病組升高(P<0.05)。見表3。

    表3 3組受試者血清miR-590 mRNA、miR-196b mRNA相對表達量比較

    2.3 不同程度IgA 腎病患兒血清miR-590 mRNA、miR-196b mRNA相對表達量比較

    不同程度IgA腎病患兒miR-590 mRNA、miR-196b mRNA 相對表達量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),IgA 腎病組患兒miR-590 表達水平隨病情加重依次下降(P<0.05),miR-196b 表達水平隨病情加重依次升高(P<0.05)。見表4。

    表4 不同程度IgA腎病患兒血清miR-590 mRNA、miR-196b mRNA相對表達量的比較

    2.4 miR-590、miR-196b 單獨及兩者聯(lián)合對IgA腎病的診斷作用

    miR-590 對IgA 腎病診斷 的AUC 為0.873(95% CI:0.809,0.920),最佳截斷值為0.737,敏感性為84.1%(95% CI:0.748,0.910)、特異性為82.6%(95% CI:0.716,0.907);miR-196b 對IgA 腎病診斷的AUC 為0.785(95% CI:0.713,0.847),最佳截斷值為1.927,敏感性為90.7%(95% CI:0.838,0.945)、特異性為64.8%(95% CI:0.513,0.750);兩者聯(lián)合檢測對IgA 腎病診斷的AUC 為0.914(95% CI:0.858,0.952),敏感性為88.6%(95% CI:0.801,0.944)、特異性為87.0%(95%CI:0.767,0.939)。見圖1。

    圖1 miR-590、miR-196b及兩者聯(lián)合檢測對IgA腎病診斷的ROC曲線

    3 討論

    研究[12]表明,糖基化異常的IgA 分子與抗聚糖IgG 自身抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物在血液循環(huán)中逃脫正常清除機制,在腎小球系膜區(qū)沉積,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)與系膜細胞的增殖導(dǎo)致腎小球損傷,是造成IgA 腎病的原因之一。林佳如等[13]研究表明,Th17 細胞免疫失衡在調(diào)控IgA 糖基化過程中發(fā)揮重要作用。研究[7]顯示,miR-590 mimics 可增強免疫效應(yīng)細胞的生存率,阻斷舌癌的免疫逃逸,進而減少免疫活性細胞凋亡。ZHOU 等[14]研究表明,miR-590 通過控制IL-2 表達對T 細胞免疫應(yīng)答,抑制結(jié)直腸癌血管生成和轉(zhuǎn)移。BROGAARD 等[15]研究顯示,miR-590 是豬對甲型H1N2 流感肺部免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子。研究[8]顯示,miR-590 可抑制膿毒癥小鼠腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 表達從而減輕小鼠急性腎損傷程度。miR-590 通過靶向tob1 促進致病性th17 細胞分化,與多發(fā)性肝硬化有關(guān)[16]。以上研究均顯示,miR-590 可能與機體免疫活性密切相關(guān)。本研究IgA 腎病患兒血清miR-590 mRNA 相對表達量低于非IgA 腎病患兒及健康兒童,且隨IgA 腎病患兒病情加重而依次降低,提示miR-590 與IgA 腎病的發(fā)病、發(fā)展可能有一定聯(lián)系,猜測可能通過影響免疫系統(tǒng)平衡參與IgA 腎病發(fā)生,具體機制有待進一步研究。本研究ROC 結(jié)果顯示,血清miR-590 水平對診斷IgA 腎病的曲線下面積為0.873,特異性和敏感性均在80%左右,提示miR-590 可能作為診斷IgA 腎病的生物學(xué)指標,截斷值為0.737,表明miR-590 水平低于0.737 者發(fā)生IgA 腎病的風(fēng)險高,為基礎(chǔ)研究者和臨床診治者進行IgA 腎病研究及治療提供了miRNA 靶點。

    研究表明,異常糖基化IgA 不足以致病,機體在氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生大量活性氧,ROS 堆積導(dǎo)致抗氧化防御系統(tǒng)遭到破壞,脂質(zhì)過氧化物造成細胞膜轉(zhuǎn)運功能障礙,酶活力、亞細胞器功能改變,自由基可經(jīng)離子通道進入細胞內(nèi)破壞細胞器成份,造成組織細胞損傷導(dǎo)致IgA 腎病的發(fā)生[17]。miR-196b 是miR-196 家族成員之一,位于人7p15.2 的進化高度保守區(qū)域[18]。孟嬌等[19]從IgA腎病患者活檢標本繪制出miRNA 表達圖譜,發(fā)現(xiàn)IgA 腎病患者中miR-196b等65 種miRNA 分子表達下調(diào),且降低程度與病情嚴重程度密切相關(guān),提示miR-196b 在早期IgA 腎病的病理發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本研究IgA 腎病患兒血清miR-196b 表達水平高于非IgA 腎病患兒及健康兒童,提示miR-196b 與IgA 腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。李慧聰?shù)萚20]研究表明,miR-196 高表達通過抑制二硫化物異構(gòu)酶A3 表達,進而抗氧化應(yīng)激能力減弱參與小鼠腎臟損傷。猜測miR-196 可能通過氧化應(yīng)激損傷途徑參與IgA 腎病的發(fā)生。進一步研究顯示,血清miR-196b 水平診斷IgA 腎病發(fā)病的曲線下面積為0.785,敏感性高,但特異性為64.8%,提示miR-196b 僅能作為輔助指標判別患兒是否發(fā)生IgA 腎病。本研究發(fā)現(xiàn)miR-590、miR-196b兩者聯(lián)合檢測診斷IgA 腎病曲線下面積、敏感性、特異性大或高于miR-590、miR-196b 對IgA 腎病的診斷效果。提示聯(lián)合檢測效果優(yōu)于單一檢測,可能作為臨床診斷IgA 腎病的輔助檢測指標,有利于先篩查出高危IgA 腎病患兒,再進一步進行腎活檢,從而優(yōu)化疑似IgA 腎病的診斷流程。

    綜上所述,IgA 腎病患兒血清miR-590 低表達、血清miR-196b 高表達,兩者聯(lián)合檢測對IgA 腎病具有較高診斷價值。但本研究存在一定不足,由于樣本量較少,可能對本結(jié)果造成一定偏倚,此外對于miR-590、miR-196b 參與IgA 腎病的發(fā)病機制有待進一步研究。

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