經(jīng)PCI治療急性ST段抬高型心肌梗死患者血漿的代謝組學(xué)研究

尹倩倩，李今朝

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 錦州121011）

急性ST 段抬高型心肌梗死（acute ST-elevation myocardial infarction, STEMI）是冠心病的嚴重類型，為致死致殘的主要原因，其發(fā)病突然，進程兇險，轉(zhuǎn)歸難以預(yù)測，且發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[1-2]。 經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention, PCI）是目前臨床治療STEMI 的首選方法之一[3]。但由于院前及院內(nèi)等延誤導(dǎo)致部分STEMI 患者再灌注不及時，術(shù)后仍有心律失常、心功能不全等心血管不良事件發(fā)生的風(fēng)險，影響患者預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。生物體受到內(nèi)、外界刺激后，體內(nèi)的代謝產(chǎn)物會發(fā)生變化，代謝組學(xué)就是通過分析內(nèi)源性代謝物的變化來反映機體的狀態(tài)。本研究旨在利用靶向代謝組學(xué)方法研究行PCI 治療的STEMI 患者的血液代謝譜，篩選差異代謝物，探究與STEMI預(yù)后可能相關(guān)的標(biāo)志物，為及早開通閉塞冠狀動脈（以下簡稱冠脈）帶來的獲益提供代謝組學(xué)方面的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2019年3月－2019年9月經(jīng)急診就診于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院診斷為STEMI，并行PCI治療的患者43 例。STEMI 患者入選標(biāo)準(zhǔn)參照2019 版《急性ST 段抬高性心肌梗死診斷和治療指南》[4]，排除標(biāo)準(zhǔn)：①有陳舊性心肌梗死病史，曾行冠脈搭橋術(shù)、溶栓治療行補救性PCI 者；②風(fēng)濕熱、先天性心臟疾病、心肌炎、心肌病等其他心臟疾病者；③合并嚴重全身感染、腦血管疾病、風(fēng)濕病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、骨關(guān)節(jié)病及肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴重疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，所有入選患者均自愿參與且簽署知情同意書。

1.2 方法

《急性ST 段抬高性心肌梗死診斷和治療指南》[4]提出120 min 內(nèi)能完成PCI 治療的首選PCI，否則應(yīng)在首次醫(yī)療接觸（first medical contact,FMC）30 min 內(nèi)開始溶栓。本研究將＜120 min 完成PCI 的定義為A 組（20 例），＞120 min 未溶栓行PCI 治療的定義為B 組（23 例）。記錄兩組患者院內(nèi)及隨訪期間心血管不良事件發(fā)生情況與心臟彩超左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction, LVEF）。分別于PCI術(shù)前、術(shù)后第2天、術(shù)后1 個月采指尖血，滴于專用采血濾紙上晾干后送檢。

參照文獻[5]進行樣本預(yù)處理。將氨基酸內(nèi)標(biāo)和肉堿內(nèi)標(biāo)分別加入1 mL 純甲醇，將這些同位素標(biāo)準(zhǔn)品混合在一起儲存在4℃冰箱中，使用時再將其稀釋100 倍作為工作溶液。每100 μL 工作溶液被分配到一個含有干血點樣本（DBS）圓盤的孔中。在室溫下輕輕搖動平板20 min，3 000 r/min 離心2 min，將濾液收集到新的96 孔平板中，每個平板中加入質(zhì)量控制（QC）樣本監(jiān)測代謝組學(xué)分析測得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。濾液和QC 溶液在50℃下用純氮氣干燥。每個干燥樣品在60 μL 1-丁醇和乙酰氯的混合物（90∶10）中，65℃下衍生20 min。50℃下再次用純氮氣干燥衍生溶液。在代謝組學(xué)分析之前，將100 μL 流動相溶液加入到每個孔中。

最后進行代謝組學(xué)分析。在裝有電噴霧電離（ESI）源的ABSCIEX 4000 QTrap 系統(tǒng)上進行直接進樣質(zhì)譜分析，并以正模式掃描。進樣量、流速、質(zhì)樸分析離子噴射電壓、離子源氣體壓力等均參照文獻[5]。共檢測到23 種氨基酸、35 種肉堿、9 種氨基酸之間的比值、26 種肉堿之間的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 和SIMCA 14.1 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗；患者的代謝組數(shù)據(jù)進行預(yù)處理后構(gòu)建主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型，用Permutation 驗證OPLS-DA 模型的有效性。差異代謝物根據(jù)VIP 值、VIP 置信區(qū)間、差異倍數(shù)進行篩選。

2 結(jié)果

2.1 STEMI 患者住院及短期隨訪期間（1 個月）心血管不良事件發(fā)生情況

兩組患者住院時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），A 組較B 組短；兩組患者心衰和心律失常發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A 組低于B 組；兩組患者再發(fā)心肌梗死率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表1）。既往文獻顯示心血管不良事件還應(yīng)包括死亡[6-7]，本研究需抽取患者術(shù)后1 個月血液，因此該類患者除外。

表1 兩組患者住院時間、心衰、心律失常、再發(fā)心肌梗死的比較

2.2 兩組患者術(shù)后住院期間及術(shù)后1個月LVEF的比較

兩組患者PCI 術(shù)后住院期間及術(shù)后1 個月隨訪時的LVEF 值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），A 組均高于B 組。見表2。

表2 兩組患者術(shù)后住院期間及術(shù)后1個月LVEF的比較（±s）

表2 兩組患者術(shù)后住院期間及術(shù)后1個月LVEF的比較（±s）

組別A組n 20術(shù)后住院期間51.70±6.70術(shù)后1個月52.05±5.91 B組t 值P 值23 44.91±7.20 3.185 0.030 45.30±6.83 3.437 0.010

2.3 代謝輪廓對疾病狀態(tài)的區(qū)分能力

PCA對兩組患者入院時、術(shù)后第2天、術(shù)后1個月的血漿代謝物進行初步分析，得到3 個PCA 模型。A：入院時血漿代謝物無分離（見圖1A）；B：術(shù)后第2 天代謝物有一定的區(qū)分趨勢（見圖1B）；C：術(shù)后1 個月時代謝物區(qū)分聚類趨勢較明顯（R2X =49.6%，Q2 =11.8%）（見圖1C）。術(shù)后1 個月將患者的代謝物進一步構(gòu)建OPLS-DA 模型，該模型能很好地區(qū)分A、B 兩組患者，且模型有較好的擬合性和預(yù)測能力（R2Y =89.7%，Q2Y =74.2%）（見圖2）。Permutation 實驗證明OPLS-DA 模型是穩(wěn)定的、有效的[截 距：R2 （0.0，0.441） Q2 （0.0，-0.518）]（見圖3）。

圖1 STEMI患者血漿代謝輪廓模型

圖2 術(shù)后1個月時OPLS-DA模型

圖3 Permutation實驗

2.4 差異性代謝物的篩選

檢測到的93 個代謝物及其含量值全部導(dǎo)入SIMCA 軟件中，OPLS-DA 模型中篩選兩組間變量重要性投影得分（VIP）＞1.0 代謝物（見圖4），且排除系數(shù)圖上置信區(qū)間包含0 的變量（見圖5）；再結(jié)合差異倍數(shù)＜0.833 3 或≥1.2，最終篩選出14 個差異代謝物，見表3。將所選代謝物與患者術(shù)后1 個月LVEF 進行Spearman 相關(guān)分析，得出C5、C8、C10、C12、C14∶1、C16、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸與心臟LVEF 呈負相關(guān)（r=-0.316、-0.440、-0.322、-0.389、-0.414、-0.283、-0.375、-0.428 和-0.347，P=0.039、 0.003、 0.035、 0.010、 0.006， 0.041，0.047，0.004 和0.023）；C3、C4、C3DC、C5DC、蘇氨酸與LVEF 無相關(guān)性（P＞0.05）。

圖4 VIP圖

圖5 系數(shù)圖

表3 A、B兩組主要差異代謝物

3 討論

近些年來，隨著代謝組學(xué)的興起，其逐漸成為生命科學(xué)不可缺少的研究領(lǐng)域。代謝組學(xué)通過對血、尿等進行檢測、分析，對疾病發(fā)生、發(fā)展中伴隨的生化變化有了全新的認識和了解，進而發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生相關(guān)的生物標(biāo)志物及病理分子機制，最終達到臨床診斷、治療的目的[8-9]。目前代謝組學(xué)被廣泛應(yīng)用于心血管領(lǐng)域。

早期、快速、完全地開通梗死相關(guān)動脈，可使缺血心肌迅速恢復(fù)血液灌注，進而挽救瀕死心肌，降低心肌梗死危險程度，縮小心肌梗死面積，避免心臟構(gòu)型發(fā)生改變[10]及維持心功能是STEMI 患者預(yù)后的關(guān)鍵[4]。本研究A 組患者發(fā)病至冠狀動脈開通時間短（≤2 h），心功能接近正常，心血管不良事件發(fā)生較B 組低，與已有報道一致[6，11]。由于本研究樣本量偏少，且隨訪時間相對較短，再發(fā)心肌梗死率在兩組間無差異。由于心衰是STEMI 最常見的并發(fā)癥，也是最重要的預(yù)后不良指標(biāo)之一[12]，而LVEF 是診斷心衰的標(biāo)準(zhǔn)之一，因此又對兩組患者的LVEF 進行比較，同樣無論住院還是院外隨訪期間，及早開通閉塞冠狀動脈的A 組的LVEF 值高于B組。通過分析篩選出的A、B 組術(shù)后1 個月血液差異代謝物與心臟超聲LVEF 進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，代謝物高，超聲指標(biāo)相應(yīng)較差，高代謝物可能與心肌梗死后心功能較差有關(guān)，本研究也主要討論代謝物與心肌梗死后心功能不全這一心血管不良事件的關(guān)系。

亮氨酸、纈氨酸屬支鏈氨基酸（branched chain amino acids, BCAA），BCAA 是人體必需的氨基酸，除了合成蛋白質(zhì)外，還是調(diào)節(jié)細胞代謝和生長的重要信號分子。王維等[13]通過復(fù)制小鼠心肌梗死模型發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后會發(fā)生BCAA 代謝紊亂，導(dǎo)致BCAA 累積，飼喂BCAA 加重其累積后又發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后的心功能紊亂和心肌重構(gòu)進一步加重，這一結(jié)果證明BCAA 累積直接參與了心肌梗死后的心衰進程。心肌梗死行PCI 治療后，組織細胞損傷加重，即缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury, IRI）[14-15]。研究證實，氧化應(yīng)激是IRI 的主要發(fā)生機制[16]，活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）在其中扮演極其重要的角色。廉坤通過小鼠模型證實，高BCAA 血癥加重小鼠心肌IRI，增加ROS 水平，即高BCAA 血癥有心臟“毒性”作用，且該作用與氧化應(yīng)激有關(guān)[13]。DU 等運用靶向質(zhì)譜法測定PCI 術(shù)后發(fā)生心血管不良事件和未發(fā)生心血管不良事件的STEMI 患者入院時26 種氨基酸代謝產(chǎn)物的濃度，確定BCAA 在區(qū)分有心血管不良事件和無心血管不良事件的患者中具有極高的價值。并推測這一現(xiàn)象與先前研究確定的BCAA 分解代謝異常與心肌梗死和IRI 之間的相關(guān)性有關(guān)[17-18]。STEMI患者血管重建時間延長，心肌細胞受損程度要高于及時進行血運重建者，細胞缺血、缺氧更重，持續(xù)時間更長，加上心肌梗死發(fā)生時機體處于應(yīng)激狀態(tài)，引發(fā)心肌細胞更顯著的自噬效應(yīng)來降解蛋白質(zhì)為氨基酸以維持心臟功能和活力[19-20]，因此本研究得出亮氨酸、纈氨酸含量在B 組含量相對較高。

肉堿是一種親水性氨基酸衍生物，以游離肉堿和?；鈮A兩種形式存在，有L-肉堿（有生物活性）及D-肉堿兩種異構(gòu)體。有實驗發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈閉塞后，脂肪酸將升高；脂肪酸的累積會損傷線粒體功能和呼吸鏈，不能進入線粒體進行能量代謝，進而導(dǎo)致?；鈮A的累積。本研究發(fā)現(xiàn)C10、C12 等?；鈮A在B 組含量較高，可能與B 組患者心肌缺血、缺氧時間更長有關(guān)。LIEPINSH 等[21]通過復(fù)制動物心肌IRI 模型發(fā)現(xiàn)，?；鈮A積聚到足夠濃度能抑制線粒體氧化磷酸化，刺激線粒體ROS的產(chǎn)生，損傷線粒體并增加心肌梗死面積，從而得出在線粒體中抑制?；鈮A的產(chǎn)生有可能是一個有價值的心臟保護藥物靶點的結(jié)論。還有研究證實，升高的長鏈?；鈮A類物質(zhì)會損害生物膜、鈉泵及鈣泵，導(dǎo)致膜的脂質(zhì)雙分子層流動性降低、細胞腫脹、鈣超載等，甚至導(dǎo)致細胞死亡[22]。血液中肉堿積聚對心肌梗死后心功能產(chǎn)生不利影響，然而補充肉堿后可令心肌梗死后心肌獲益。XUE等[23]通過復(fù)制小鼠IRI 模型發(fā)現(xiàn)，再灌注前腹腔注射左旋肉堿，可顯著改善心臟功能;進一步研究表明這一機制可能與激活PI3K 通路有關(guān)，上調(diào)p-Akt 和Bcl-2（抗凋亡）蛋白的表達，下調(diào)Bax-2（抑制Bcl2，促進細胞凋亡）蛋白的表達，抑制IRI期細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，越早開通STEMI 患者閉塞冠狀動脈，預(yù)后越好，較高的代謝物亮氨酸、纈氨酸及長鏈?；鈮A等與心肌梗死后心功能不全有關(guān)。從代謝組學(xué)方面深化了對STEMI 患者及早進行血管重建的認識，并對心肌梗死后心功能不全的可能發(fā)生機制從代謝組學(xué)方面找到了新的研究方向。本研究由于樣本量偏少，隨訪時間較短，且樣本行代謝組學(xué)檢測本身受多種因素影響，有其局限性，因此有待于深入研究。