血清長(zhǎng)鏈非編碼RNA Rpph1表達(dá)對(duì)2型糖尿病患者蛋白尿進(jìn)展的預(yù)測(cè)價(jià)值研究

吳翔，毛盛程，陳浪

（浙江省立同德醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 杭州310012）

2 型糖尿病近年在我國(guó)的發(fā)病率逐步升高，隨病情加重產(chǎn)生各種急慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至威脅生命。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）是最為常見的糖尿病微小血管并發(fā)癥，是終末期腎病的主要病因之一。該病存在復(fù)雜的代謝紊亂，且一旦進(jìn)展至終末期腎病，其治療比其他腎臟疾病更棘手[1-3]。早期預(yù)防DN 的發(fā)生及延緩其進(jìn)展具有重要的臨床意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）缺乏編碼蛋白質(zhì)的能力，被發(fā)現(xiàn)影響多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。其中，lncRNA Rpph1 被發(fā)現(xiàn)可影響高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)[4]，推測(cè)其參與慢性腎病的炎癥過程。目前關(guān)于lncRNA Rpph1 與DN 內(nèi)在聯(lián)系的研究較少，本研究以此為切入點(diǎn)探討lncRNA Rpph1 對(duì)DN 病情進(jìn)展的影響，旨在進(jìn)一步研究DN的發(fā)病機(jī)制，為后續(xù)治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為前瞻性研究。選取2016年1月—2018年1月浙江省立同德醫(yī)院內(nèi)分泌科因控制血糖重復(fù)住院治療的2 型糖尿病患者268 例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①明確的2 型糖尿病史；②首次及第2 次住院治療的時(shí)間間隔2～4年；③首次住院時(shí)留取血清樣本；④首次住院時(shí)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并1 型糖尿病或其他類型糖尿病；②合并糖尿病酮癥酸中毒或其他嚴(yán)重糖尿病合并癥；③合并甲狀腺功能異常、垂體瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤等其他內(nèi)分泌疾病；④合并急慢性基礎(chǔ)腎臟疾病；⑤合并惡性腫瘤；⑥入院前2 個(gè)月內(nèi)有激素、利尿劑應(yīng)用史。

1.2 方法

1.2.1 收集所有患者首次入院的臨床資料 性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、糖尿病家族史、糖尿病病程、吸煙、飲酒、合并癥、用藥情況、空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、 血肌酐（Scr）、 尿素氮（BUN）、血尿酸。

1.2.2 24 h 尿蛋白檢測(cè)及分組 微量蛋白尿是診斷DN 的標(biāo)志，指尿蛋白定量為30～300 mg/24 h。本研究通過24 h 尿蛋白檢測(cè)，定義24 h 尿蛋白定量＜30 mg 為無蛋白尿，24 h 尿蛋白定量≥30 mg 但＜300 mg 為微量蛋白尿，24 h 尿蛋白定量≥300 mg 為大量蛋白尿。檢測(cè)所有患者首次、再次入院的尿蛋白定量。同一患者再次入院后，由之前的無蛋白尿進(jìn)展至微量蛋白尿，或者由微量蛋白尿進(jìn)展至大量蛋白尿，或者大量蛋白尿患者Scr 水平翻倍為蛋白尿進(jìn)展。以此為分組依據(jù)將患者分為蛋白尿進(jìn)展組（n=62）和蛋白尿非進(jìn)展組（n=206）。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量 留取初次入院患者的空腹外周靜脈血標(biāo)本5 mL，4℃下靜置30 min，室溫下3 000 r/min 離心15 min，取上清液冷凍保存于-80℃冰箱。Trizol（購(gòu)自上海百蕊生物科技有限公司）提取血清樣本中的總RNA，參照AMV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自上海索寶生物科技有限公司）說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，采用2×SYBR Green PCR Master Mix 進(jìn)行qRT-PCR，qRT-PCR 試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。以P53為內(nèi)參。引物序列檢測(cè)及合成由生工生物工程（上海）有限公司完成。lncRNA Rpph1 引物：正向5'-TTCGAACGATGATCGATGA-3'，反向5'-CTGAAGCTAAGCTGAGTCG-3'；P53 引 物：正 向5'-AGCTTGTCAGAACGTAGCT-3'，反向5'-CTTGAA CGTTAGCGATAG-3'。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、正反向引物各0.6 μL、去離子水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA Rpph1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；繪制ROC 曲線；影響因素的分析采用多因素Logistic 回歸模型。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者首次入院的臨床資料比較

兩組患者首次入院的糖尿病病程、合并高血壓、使用二甲雙胍、Scr、血尿酸、lncRNA Rpph1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組患者首次入院的性別、年齡、BMI、糖尿病家族史、吸煙、飲酒、合并冠心病、使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）/血管緊張素受體拮抗劑（ARB）、使用胰島素、使用他汀類藥物、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C、BUN 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者首次入院的臨床資料的比較

2.2 蛋白尿進(jìn)展的影響因素分析

以再次入院后蛋白尿進(jìn)展為因變量（0=非蛋白尿進(jìn)展，1=蛋白尿進(jìn)展），將首次入院的臨床資料單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)（糖尿病病程、合并高血壓、使用二甲雙胍、Scr、血尿酸、lncRNA Rpph1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量）為自變量，納入Logistic 回歸模型，結(jié)果：合并高血壓[=3.271（95% CI：1.864，3.872）]、使用二甲雙胍[=2.192（95% CI：1.253，2.413）]、Scr 水 平[=1.873（95% CI：1.211，2.063）]、血 酸水平[=2.321（95% CI：1.432，2.784）]、lncRNA Rpph1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量[=2.621（95% CI：1.732，3.064）]是2 型糖尿病患者蛋白尿進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表2。

表2 白蛋白尿進(jìn)展影響因素的多因素Logistic回歸分析參數(shù)

2.3 血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量對(duì)蛋白尿進(jìn)展的預(yù)測(cè)價(jià)值

首次入院血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)蛋白尿進(jìn)展的最佳截?cái)嘀禐?.564，曲線下面積（AUC）為0.800（95% CI：0.742，0.858），敏感性為67.48%（95% CI：0.517，0.784），特異性為82.26%（95%CI：0.684，0.935）。見圖1。

圖1 血清lncRNA Rpph1 mRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)蛋白尿進(jìn)展的ROC曲線

3 討論

DN 的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能涉及遺傳、腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常、高血糖致代謝異常、血管活性物質(zhì)代謝異常等多因素[5-7]，但部分初始病情相似患者的疾病進(jìn)展速度存在較大差異，推測(cè)存在其他影響疾病進(jìn)展的因素。DN 患者開始出現(xiàn)蛋白尿并隨病情進(jìn)展尿蛋白定量逐步增加，是病情惡化的重要標(biāo)志[8-10]。本研究使用Logistic 回歸模型分析蛋白尿進(jìn)展的影響因素發(fā)現(xiàn)：合并高血壓、使用二甲雙胍、Scr 水平、血尿酸水平、lncRNA Rpph1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高均是2 型糖尿病患者蛋白尿進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

高血壓是腎病發(fā)生的重要促發(fā)因素[11-12]；二甲雙胍可能增加腎功能不全者乳酸酸中毒的風(fēng)險(xiǎn)[13-14]；Scr 是最為重要的腎功能指標(biāo)之一，2 型糖尿病患者早期Scr 水平較高提示其腎功能存在潛在損傷，腎臟組織對(duì)高血糖帶來的一系列代謝紊亂的耐受度較弱[15-17]；血尿酸也在不同研究中被證實(shí)是DN 進(jìn)展的重要因素之一，可能與高尿酸血癥加速腎血管內(nèi)皮功能紊亂、促進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)等機(jī)制相關(guān)[18-20]。

既往研發(fā)現(xiàn)lncRNA Rpph1 可誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷[21]；且可促進(jìn)外泌體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2 極化，促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移[22]，但關(guān)于lncRNA Rpph1 與糖尿病及DN 的研究較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量較高與DN 患者蛋白尿進(jìn)展密切相關(guān)，這是繼張攀揚(yáng)等[4]的研究后，再次明確了lncRNA Rpph1 高表達(dá)對(duì)DN 病情進(jìn)展的意義。ZHANG 等[23]研究指出，在7 個(gè)與DN 相關(guān)的lncRNAs 中發(fā)現(xiàn)lncRNA Rpph1 表達(dá)顯著升高，且在高糖狀態(tài)下可通過Gal-3/Mek/Erk 信號(hào)通路促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng)下調(diào)lncRNA Rpph1 表達(dá)，提示lncRNA Rpph1 通過Gal-3/Mek/Erk 信號(hào)通路影響DN 的腎臟炎癥反應(yīng)。DN 的病情進(jìn)展與炎癥密切相關(guān)，肖瑛等[24]也證實(shí)抑制炎癥反應(yīng)可減輕DN 大鼠的腎組織纖維化。有研究[25]報(bào)道，lncRNA Rpph1激活腎臟炎癥反應(yīng)的作用可能是其成為DN 病情近期進(jìn)展的重要原因，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

lncRNA Rpph1 的表達(dá)變化在DN 蛋白尿進(jìn)展中起重要作用，本研究進(jìn)一步探討其對(duì)蛋白尿進(jìn)展的預(yù)測(cè)價(jià)值。ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)：首次入院血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)蛋白尿進(jìn)展的最佳截?cái)嘀禐?.564，AUC 為0.800，敏感性為67.48%，特異性為82.26%。以上結(jié)果提示，早期血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)對(duì)后續(xù)DN 患者蛋白尿進(jìn)展具有預(yù)測(cè)價(jià)值，可能成為后續(xù)DN 患者病情進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)篩查、針對(duì)性干預(yù)措施制訂的參考指標(biāo)。

綜上所述，血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量是2 型糖尿病患者蛋白尿進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，其對(duì)蛋白尿進(jìn)展具有預(yù)測(cè)價(jià)值。