丹紅注射液對(duì)急性心肌梗死大鼠的治療性血管新生作用研究

衛(wèi) 國(guó)，王慧芳，劉 娟，劉迎賓，王艷華，殷 英

近年來(lái)，通過(guò)給予藥物或血管新生調(diào)節(jié)因子等外源性干預(yù)措施促進(jìn)血管新生即治療性血管新生，逐漸成為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery heart disease，CAHD)治療的重點(diǎn)關(guān)注領(lǐng)域[1]。中藥因其多靶點(diǎn)、多機(jī)制、安全性高等優(yōu)勢(shì)，在CAHD治療性血管新生療法中愈來(lái)愈受到關(guān)注[2]。丹紅注射液(danhong injection，DHI)是由丹參和紅花兩味傳統(tǒng)中藥按一定比例配伍制成的中藥注射劑，具有通脈生絡(luò)，去瘀生新的功效，能有效治療血脈痹阻所致的“胸痹”或者“真心痛”。但目前DHI對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用與其“生新”功能的相關(guān)性研究較少，該研究主要考察DHI對(duì)急性心肌梗死(acute myocardium infarction，AMI)大鼠缺血心肌的保護(hù)作用和對(duì)冠狀動(dòng)脈血管新生的促進(jìn)作用，從而明確DHI對(duì)AMI損傷是否具有治療性血管新生作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠40只，SPF級(jí)，體質(zhì)量250～280 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK- (軍)2012-0007。

1.1.2儀器與設(shè)備 HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技公司)；BL-420S系列生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技公司)；IX71+DP72型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；Vevo 770型小動(dòng)物超聲波影像診斷儀(加拿大 visualsonics公司)；LMT260-XY圖像采集系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司)；CHEMIDOC凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；5804R型冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.1.3試藥與試劑 DHI(10 ml/支，批號(hào)：14121025)由山東丹紅制藥有限公司生產(chǎn)；伊文思藍(lán)(evans blue，EB)、2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑藍(lán)(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；T型肌鈣蛋白(troponin T，TN-T)試劑盒、腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；兔抗大鼠血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(cell adhesion 34，CD34)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)、血管假性血友病因子(von willebrand factor，vWF)、兔抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-Smooth muscle actin，α-SMA)、兔抗大鼠β-肌動(dòng)蛋白(beta-actin，β-actin)一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；水合氯醛、多聚甲醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥 40只大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、DHI低(0.5 ml/kg)、中(1.0 ml/kg)、高(2.0 ml/kg)劑量組；每組8只。造模24 h后給藥，尾靜脈注射，每天一次，模型組和假手術(shù)組給予生理鹽水(2 ml/kg)，連續(xù)給藥7 d后取材。

1.2.2大鼠AMI模型制備 大鼠稱重，按4 ml/kg 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥位固定于專用木板上，連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖；行氣管插管術(shù)并連接呼吸機(jī)，設(shè)置呼吸機(jī)參數(shù)(頻率：75次/min；潮氣量：8～9 ml；呼吸比=2 ∶1)；于第3～5肋間開(kāi)胸，充分暴露心臟，剪開(kāi)心包膜，于左心耳下方1～2 mm處進(jìn)針，繞左冠狀動(dòng)脈前降支穿線、結(jié)扎；以大鼠心臟左室前壁變白且心電圖ST段出現(xiàn)明顯抬高(幅度>0.2 mV)，表明模型建立成功；關(guān)閉胸腔，排除胸腔氣體，逐層縫合。待大鼠恢復(fù)自主呼吸，撤去呼吸機(jī)，將大鼠置溫箱中，待其自然蘇醒。術(shù)后每只大鼠按150萬(wàn)U/(kg·d)腹腔注射青霉素，連續(xù)3 d，以預(yù)防感染。

1.2.3心功能測(cè)定 采用超聲心動(dòng)圖法評(píng)價(jià)大鼠心功能。術(shù)前及末次給藥后6 h測(cè)定，以二維超聲(頻率 15 MHz)和 M 型超聲檢測(cè)左室收縮功能指標(biāo)，記錄左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)，計(jì)算大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。各參數(shù)均計(jì)算 3 個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.2.4取材與樣本處理 每組剩余存活大鼠第2次心功能測(cè)定完畢后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血2 ml，供血清生化指標(biāo)測(cè)定；隨后處死大鼠，取出心臟，剪取左心室梗死區(qū)域邊緣心肌組織，分為2份，一份置-80 ℃保存，供免疫印跡實(shí)驗(yàn)用；另一份4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水、石蠟包埋，切片，供免疫組化(HE染色和CD34染色)實(shí)驗(yàn)用。

1.2.5血清生化指標(biāo)測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定，從大鼠腹主動(dòng)脈抽血2 ml至肝素管，靜置15 min，3 000 r/min離心20 min，留血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作步驟測(cè)定其中的TN-T和BNP含量。

1.2.6HE染色 取“1.2.4”中制備的石蠟切片，脫蠟至水，蘇木精染色，水洗后鹽酸乙醇分化，自來(lái)水沖洗，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞。

1.2.7微血管密度(microvessel density，MVD)測(cè)定 取“1.2.4”中制備的石蠟切片，采用免疫組化法(SP法)染色，DAB顯色，其中CD34抗體濃度為1 ∶200；用抗體稀釋液代替一抗作為陰性對(duì)照。染色后，先用低倍鏡(×40視野下)掃視玻片，找到梗死邊緣區(qū)血管密度最高的區(qū)域，然后在高倍鏡下(×400視野下)計(jì)數(shù)視野內(nèi)被染色的血管數(shù)。凡呈棕黃色的單個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇均被計(jì)數(shù)，但管腔>25 μm的血管除外。計(jì)算單位面積內(nèi)微血管的數(shù)量，即MVD，隨機(jī)選取5個(gè)視野/張，計(jì)算平均值。

1.2.8蛋白表達(dá)測(cè)定 采用免疫印跡(Western blot)法測(cè)定。取“1.2.4”中-80 ℃保存心肌組織，剪碎，冰浴條件下，加入蛋白裂解液裂解，冷凍離心機(jī)中(4 ℃，12 000 r/min)離心20 min，取上清，用考馬斯亮蘭蛋白定量試劑盒定量；煮沸法行蛋白變性后取等量蛋白經(jīng)SDS-PAGF電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，37 ℃下脫脂奶粉封閉，加入1 ∶1 000稀釋的vWF、α-SMA、VEGF-A、β-actin一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入1 ∶5 000稀釋的羊抗兔的二抗，37 ℃孵育30 min，ECL發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行攝影分析。蛋白表達(dá)以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示，各組蛋白相對(duì)水平以其對(duì)假手術(shù)組倍數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活情況給藥結(jié)束后，40只大鼠存活34只，假手術(shù)組、模型組、DHI低、中、高劑量組大鼠分別死亡0、1、2、2和1只，死亡原因包括麻醉意外、心律失常和呼吸衰竭，各組死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2013年是全面貫徹落實(shí)黨的十八大精神的第一年和新一屆政府工作的開(kāi)局之年，也是實(shí)施“十二五”規(guī)劃承前啟后的關(guān)鍵一年。在市委、市政府的堅(jiān)強(qiáng)領(lǐng)導(dǎo)和水利部的有力指導(dǎo)下，全市各級(jí)水務(wù)部門全面貫徹落實(shí)黨的十八大和十八屆三中全會(huì)精神，著力優(yōu)化治水思路、提升水務(wù)能級(jí)，以更高的標(biāo)準(zhǔn)，全力做好申城水安全、水資源、水環(huán)境、水生態(tài)等四篇大文章，以防汛、供水、水環(huán)境、改革四個(gè)提升，為美麗中國(guó)夢(mèng)和水潤(rùn)大上海作出新貢獻(xiàn)！

2.2 DHI對(duì)AMI大鼠心功能的影響術(shù)前各組大鼠心功能比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模7 d后，假手術(shù)組大鼠心功能與術(shù)前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與假手術(shù)組大鼠LVEF(79.00±3.10)%和LVFS(39.83±3.92)%比較，模型組大鼠LVEF(35.33±4.32)%和LVFS(19.83±3.60)%下降(P<0.01)；DHI能劑量依賴性的升高大鼠LVEF和LVFS值，其中，中劑量組[LVEF(50.67±3.01)%，LVFS(26.17±2.64)%]、高劑量組[LVEF(56.00±4.82)%，LVFS(29.33±4.23)%]大鼠心功能與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 超聲心動(dòng)圖法檢測(cè)DHI對(duì)AMI大鼠心功能的影響

2.3 DHI對(duì)AMI大鼠血清TN-T和BNP水平的影響造模7 d后，模型組血清TN-T(6.30±0.68)ng/ml和BNP(125.33±6.71)pg/ml含量仍高于假手術(shù)組TN-T(0.27±0.12)ng/ml和BNP(28.83±3.87)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而給予不同劑量的DHI治療后，大鼠血清TN-T[低：(5.72±0.45) ng/ml、中：(4.78±0.47) ng/ml、高：(3.43±0.45) ng/ml]和BNP[低：(115.17±6.18) pg/ml、中：(105.17±5.23) pg/ml、高：(94.83±5.04) pg/ml)]水平均下降，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 ELISA法檢測(cè) DHI對(duì)AMI大鼠血清TN-T和BNP含量的影響A：各組血清TN-T含量；B：各組血清BNP含量；與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較： #P<0.05，##P<0.01

2.4 DHI對(duì)AMI大鼠心肌病理的影響假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠心肌細(xì)胞大量壞死，肌纖維斷裂，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；給予不同劑量DHI治療后，心肌細(xì)胞壞死程度，組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均有不同程度改善。見(jiàn)圖3。

圖3 HE染色法檢測(cè)DHI對(duì)AMI大鼠心肌病理?yè)p傷的影響 ×200 A：假手術(shù)組; B：模型組; C：低劑量組; D：中劑量組; E：高劑量組

2.5 DHI對(duì)AMI大鼠心梗邊緣區(qū)MVD的影響造模7 d后，各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)均可發(fā)現(xiàn)CD34陽(yáng)性細(xì)胞或細(xì)胞簇，即新生微血管；模型組新生血管數(shù)量即MVD值(16.80±3.03)n/mm2，較假手術(shù)組(7.60±1.82)n/mm2有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；三個(gè)劑量的DHI治療能不同程度的促進(jìn)微血管新生，與模型組比較，中(33.60±5.86)n/mm2、高(50.60±4.51)n/mm2劑量組心肌梗死邊緣區(qū)MVD值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖4 免疫組化法檢測(cè)DHI對(duì)AMI大鼠心肌梗死邊緣區(qū)MVD的影響與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.6 DHI對(duì)AMI大鼠心梗邊緣區(qū)vWF、α-SMA和VEGF-A表達(dá)的影響與假手術(shù)組(1.00±0.00)比較，模型組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)vWF(2.14±0.46)、α-SMA(1.80±0.25)和VEGF-A(1.90±0.48)表達(dá)均有不同程度升高，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05，P<0.01)；DHI治療則能更進(jìn)一步促進(jìn)這三種蛋白的表達(dá)，中、高劑量組vWF[(3.20±0.71)、(5.62±0.70)]表達(dá)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；低、中、高劑量組的α-SMA[(2.50±0.56)、(3.10±0.66)、(5.24±0.67)]和VEGF-A[(2.50±0.43)、(4.28±0.34)、(6.52±0.56)]表達(dá)均高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot法檢測(cè)DHI對(duì)AMI大鼠心肌梗死邊緣區(qū)vWF、α-SMA和VEGF-A表達(dá)的影響

3 討論

血管新生在CAHD治療中地位日漸提高。因長(zhǎng)期心肌缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡、心肌局灶性或彌漫性的纖維化以及心室重構(gòu)，進(jìn)而引起心肌舒縮功能障礙是CAHD的主要病理機(jī)制[3]；而冠狀動(dòng)脈血管新生信號(hào)的激活能促進(jìn)缺血心肌側(cè)支循環(huán)的建立，有助于恢復(fù)血供，從而挽救頓抑心肌、抑制心肌細(xì)胞死亡，減少心肌結(jié)構(gòu)性和功能性損傷。當(dāng)發(fā)生心肌梗死時(shí)，缺血心肌會(huì)適應(yīng)性的表達(dá)促血管新生因子，促進(jìn)血管再生，但這種內(nèi)源性的代償機(jī)制作用十分有限[4]；因此，通過(guò)各種方法適當(dāng)?shù)慕o予外源性促血管新生藥物，調(diào)節(jié)缺血心肌血管新生相關(guān)分子的表達(dá)，提升心肌的血管再生能力，即治療性血管新生成為目前CAHD治療的研究熱點(diǎn)。中藥因其多靶點(diǎn)、多機(jī)制、安全性高等優(yōu)勢(shì)，在CAHD治療性血管新生療法中愈來(lái)愈受到關(guān)注。

目前基礎(chǔ)研究中多采用結(jié)扎、給藥、介入、冷凍等方法制作心肌梗死模型，其中，冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法因?yàn)榭梢宰畲笙薅饶M臨床，而且更加符合心肌梗死的實(shí)際病理過(guò)程，是心肌梗死模型最為經(jīng)典和常用的制作方法[8]。本研究即通過(guò)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支制作AMI模型來(lái)考察DHI的治療性血管新生作用。心功能的變化與心肌缺血損傷程度和心臟的工作性能密切相關(guān)，而大鼠心臟LVEF和LVFS以及血清TN-T和BNP水平[9-10]都是表征大鼠的心功能的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，DHI能明顯抑制AMI引起的大鼠心臟LVEF和LVFS下降以及血清TN-T和BNP含量的增加，且呈劑量依賴性。這些結(jié)果提示，DHI能減少大鼠心肌缺血損傷，改善大鼠心功能，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。文獻(xiàn)證實(shí)，CD34、vWF、α-SMA都是微血管的標(biāo)志性分子[11-12]，本研究首先即考察了DHI對(duì)這些分子表達(dá)的影響。結(jié)果表明，DHI能劑量依賴性的增加心梗大鼠左室梗死邊緣區(qū)CD34陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)記的MVD以及vWF和α-SMA蛋白的表達(dá)。此外，VEGF-A是調(diào)節(jié)血管新生的關(guān)鍵信號(hào)分子，DHI亦能顯著上調(diào)大鼠左室梗死邊緣區(qū)VEGF-A蛋白的表達(dá)，提示DHI可以顯著促進(jìn)大鼠缺血心肌的冠狀動(dòng)脈血管新生。

綜上所述，DHI能夠減少AMI引起的大鼠心肌缺血損傷，改善大鼠心功能，其機(jī)制可能與其促血管新生作用相關(guān)。