B細胞分化漿母細胞及漿細胞的體外模型建立

劉 靜,陳惠榮,郭佳琦,馬金海

B淋巴細胞又稱骨髓依賴性淋巴細胞，由骨髓中的造血干細胞分化發(fā)育而來，在人體內(nèi)合適環(huán)境刺激下增殖分化為漿母細胞及漿細胞，而漿細胞合成和分泌免疫球蛋白，在體液免疫反應中起著至關(guān)重要的作用[1]。近十年，有越來越多的實驗研究B細胞在體外增殖分化為漿細胞的步驟，但過程繁瑣且周期長[2-3]。該研究用3個步驟建立從B細胞增殖分化成漿母細胞和漿細胞的體外模型，這種體外模型有助于對漿母細胞及漿細胞的功能進一步研究，也為研究多發(fā)性骨髓瘤一類漿細胞發(fā)育不良疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料健康捐獻者外周血單個核細胞，用CD19 MicroBeads human Isolation Kit分離B細胞，純度>95%。接種于24孔板進行細胞培養(yǎng)，分為CD40L對照組及CD40L+CpG組，每孔2 ml培養(yǎng)液,B細胞濃度為1.5×103個/L。標本已獲得健康捐贈者知情同意。

1.2 試劑與儀器CpG、白細胞介素(interleukin)-2、IL-4、IL-6、IL-21、干擾素α(interferon-α，IFN-α)、April、抗體CD19-PercP-Cy、CD27-PE/Cy7、CD38-APC、CD24-PE、CD138-N421、CD20-FITC、Fc block、培養(yǎng)液均購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；BD LSR Ⅱ流式細胞檢測儀購自美國BD公司；超凈工作臺購自蘇州市潔凈技術(shù)研究所；臺式離心機購自上海安亭科學儀器廠；溫水浴鍋和恒溫箱購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法優(yōu)化B細胞的增殖和分化。步驟1：B細胞激活，將純化的B細胞以1.5×103個/L濃度置于24孔板的RPMI1640培養(yǎng)液，10% FBS，以0.002 L/孔培養(yǎng)細胞。加入CD40L(0.05 μg/L)、IL-2(0.05 μg/L)、IL-4(0.05 μg/L)或CD40L(0.05 μg/L)、CpG (0.01 μg/L)、IL-2(0.05 μg/L)、IL-4(0.05 μg/L)培養(yǎng)4 d。步驟2：漿母細胞分化，在培養(yǎng)第4天，收集細胞并用培養(yǎng)液清洗，去除CD40L、CpG，加入細胞因子組合：IL-2(0.05 μg/L)、IL-6(0.05 μg/L)或IL-2(0.05 μg/L)、IL-6(0.05 μg/L)、IL-21(0.05 μg/L)、IFN-α(0.02 μg/L)促進漿細胞分化3 d。步驟3：漿細胞分化，在培養(yǎng)第7天，洗滌細胞，分別以IL-2(0.05 μg/L)、IL-6(0.05 μg/L)、April(0.02 μg/L)、IFN-α(0.02 μg/L)或IL-2(0.05 μg/L)、IL-6(0.05 μg/L)、IL-21(0.05 μg/L)、IFN-α(0.02 μg/L)培養(yǎng)3 d，整個過程共10 d。

1.3.1倒置顯微鏡下觀察不同時期B細胞形態(tài)學變化 B細胞激活后體積逐漸增大，在第7天及第10天觀察細胞形態(tài)變化。在每一個步驟結(jié)束用臺盼藍對細胞生存率進行測定。

1.3.2流式細胞儀分析 通過熒光素FITC結(jié)合抗CD20抗原，PE結(jié)合抗CD38抗原進行多色熒光激活細胞分選,對第7天漿母細胞(CD20-CD38+)進行染色。使用FITC結(jié)合抗CD20和PE結(jié)合抗CD138抗原對第10天的漿細胞(CD20-CD138+)進行染色。在BD LSR Ⅱ流式細胞儀上直接免疫熒光染色分析細胞。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化B細胞的增殖和分化用CD40L、CpG、IL-2、IL-4激活B細胞4 d。去除CD40L及CpG，加入IL-2、IL-21促進漿母細胞分化3 d。加入IL-2、IL-6、IFN-α、April促進漿細胞分化3 d，得到漿細胞數(shù)量及活性最佳。見表1。

2.2 倒置顯微鏡下細胞形態(tài)變化第7天及第10天倒置顯微鏡下可見B細胞在分化過程中，形態(tài)由球形變?yōu)椴灰?guī)則形，胞質(zhì)豐富，表面光滑，由分散生長逐漸到成簇生長。CD40L組及CD40L+CpG組均可見大量B細胞增殖，在第7天細胞存活率均在80.0%以上，而第10天大量細胞死亡，存活率降至39.0%。

2.3 流式細胞儀對細胞表面分子表達水平檢測步驟1：從健康人外周血單個核細胞獲得純化的B細胞，用CD40L+CpG、IL-2、IL-4激活B細胞獲得大量活性B細胞。CD40L和CpG同時刺激B細胞激活時，增殖能力會大大增強，并且誘導漿母細胞分化。第4天擴增的細胞中得到40.2% CD20+CD38-細胞，12.6% CD20-CD38++細胞，3.9% CD20-CD38+CD138++細胞。步驟2：在這個階段CD40L及CpG可以阻止?jié){細胞進一步分化，故首先去除CD40L及CpG，而IL-2、IL-21可促進漿母細胞分化和存活。如果在步驟1中用CD40L培養(yǎng)細胞，第7天細胞形態(tài)無明顯差異，但在第7天抗CD20、CD38、CD138抗原標記細胞時發(fā)現(xiàn)CD20+CD38-細胞的百分比從40.2%降至10.6%(P=0.000 1，t=0.19),此外還檢測到19.8% CD20-CD38+CD138++細胞。對比使用不同的細胞因子組合，加用IL-6及IFN-α組在細胞形態(tài)及生長情況無明顯差異，得到10.6% CD20+CD38-細胞(P=0.95,t=0.74)，57.9% CD20-CD38++細胞(P=0.91,t=0.76)，19.8% CD20-CD138++細胞(P=0.90,t=0.41)，差異無統(tǒng)計學意義，且存活率均在85.0%以上。由于3 d后漿母細胞將快速死亡，因此第2步驟培養(yǎng)不超過3 d。步驟3：為了避免漿母細胞發(fā)生快速死亡，先洗滌細胞，并加入IL-2、IL-6、IFN-α、April培養(yǎng)3 d，此階段60.0%細胞將死亡。添加細胞生長因子并不能提高細胞存活率。IL-6、IFN-α促進表達CD138的漿細胞生成，而添加IL-21并不能提高漿細胞的生成和存活率(21.0%)，換用April使細胞存活率達39.0%，存活的細胞主要由69.5% CD20-CD38++組成，其中40.1% CD20-CD38+CD138++。見表1，圖1、2。

表1 優(yōu)化體外B細胞增殖分化為漿母細胞及漿細胞的步驟(n=9)

圖1 漿母細胞及漿細胞形態(tài)

圖2 B細胞體外誘導分化表面標記分子

3 討論

B細胞在外周血、骨髓、次級淋巴組織中循環(huán)，接觸抗原后增殖分化為漿母細胞，漿母細胞進一步分化為漿細胞，而漿細胞是體液免疫的終末效應物。如果沒有合適的條件及環(huán)境，B細胞在體外存活時間非常短暫，極大限制對B細胞終端體外分化的軌跡研究[4]。本課題組通過對B細胞激活信號和細胞因子組合的研究，在以往的實驗基礎(chǔ)上，用3個步驟建立從B細胞增殖分化成漿母細胞和漿細胞的體外模型。

B細胞向漿母細胞及漿細胞的增殖分化受到提供CD40L的濾泡輔助T細胞的幫助和細胞因子提供的信號整合調(diào)節(jié)，共刺激分子和細胞因子可以促進B細胞的存活、增殖以及分化。CD40L是輔助T細胞表面配體刺激幼稚B細胞以及記憶B細胞增殖，但不能誘導漿細胞分化[5]。首先用表達CD40L的飼養(yǎng)細胞，該細胞支持人類骨髓干細胞的長期培養(yǎng)。CpG可以刺激非T細胞依賴性B細胞的增殖分化，并在后期提示誘導分泌IgM的增加。有研究[6]顯示,僅用CpG刺激外周血單個核細胞7 d后，B細胞明顯增殖并分化為漿母細胞和分泌的免疫球蛋白，CpG上調(diào)了編碼BLIMP-1的PRDM1的表達，而BLIMP-1是漿細胞分化至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子。在步驟1中將實驗分為2組，CD40L組及CD40L+CpG組，分別加入IL-2、IL-4，已經(jīng)有研究[7]提示，IL-2、IL-4可以通過ERK/ELK1信號通路的BACH2刺激活化的B細胞增殖。增殖4 d后從倒置顯微鏡上可以看到B細胞體積逐漸增大，大小均勻，由分散生長逐漸趨化成團狀，兩組細胞形態(tài)無明顯差別，細胞存活率均>95.0%。

目前報道有各種方法激活信號和細胞因子組合，以獲取最大數(shù)量的漿細胞[8]。漿母細胞在外周血中如果沒有受到趨化因子受體表達的影響被招募到黏膜或骨髓中，在外周血中存活時間非常短。正因為這些環(huán)境為漿母細胞提供生存的必要條件，使其進一步分化成為持久存活成熟的漿細胞。研究表明[9]表達CD40L和CD4+T細胞為B系統(tǒng)提供強大的共刺激信號CD40L和B細胞表面表達的CD40結(jié)合可使幼稚B細胞以及記憶B細胞增殖，但不會誘導漿細胞分化，也有研究表明[5，10]CpG在后期會抑制B細胞分化。在步驟2中，首先去除CD40L及CpG，并清洗細胞。自2000年以來，已經(jīng)有較多T細胞對B細胞的幫助進行詳盡的研究，并發(fā)現(xiàn)IL-21被認為是重要的細胞因子，人類B細胞向分泌抗體的漿細胞分化的重要因素。IL-21通過STAT1、STAT3、STAT5以及MAPK/ERK和P13K/Akt途徑，促進B細胞增殖、漿細胞分化以及大多數(shù)細胞分泌[11]。第7天可以觀察到CD40L組及CD40L+CpG組細胞形態(tài)大小基本相同，表面光滑，可見成簇細胞。在步驟2中加入不同細胞因子組合，已發(fā)表的文獻提示[10]，IL-6、IFN-α可以促進漿細胞分化，本研究對比后發(fā)現(xiàn)在步驟2中加入IL-6、IFN-α對漿細胞的分化沒有明顯影響。在IL-21 存在的情況下，CD40L誘導B細胞增殖，熒光顯微鏡下可見細胞團塊形成，但它既不促進B細胞增殖，也不誘導漿細胞形成人漿細胞及其前體在體液免疫反應中起著至關(guān)重要的作用。流式細胞儀分析可見CD20-CD38++CD138-漿母細胞階段。

在步驟3中，CD40L組和CD40L+CpG組細胞形態(tài)基本相同，細胞存活率均>30%。有研究[12]表明，表達CD40L和分泌IL-21的CD4+T細胞為B系統(tǒng)提供強大的共刺激信號CD40L和B細胞表面表達的CD40結(jié)合可使幼稚B細胞以及記憶B細胞增殖，但不會誘導漿細胞分化，April是腫瘤壞死因子家族成員，作為增殖誘導配體，在漿細胞的分化及抗體類別轉(zhuǎn)換的作用越來越受到重視[13]。用April培養(yǎng)3 d，在建模第10天CD20-CD38++CD138++漿細胞表達增加。通過檢測提示獲得的漿細胞優(yōu)先來源于記憶B細胞，并具有類似于人骨髓漿細胞的CD138++表型通過模仿T細胞的輔助功能提供CD40L，樹突細胞產(chǎn)生的細胞因子，來模仿B細胞增殖和分化過程。除了研究B細胞體外增殖分化外，該體外模型同樣對進一步了解多發(fā)性骨髓瘤中漿細胞發(fā)育不良的分子學具有重要意義，而尋找多發(fā)性骨髓瘤骨髓環(huán)境是否可以在體外觸發(fā)這些漿細胞存活[14]，也將帶給研究人員新的思路。