• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    數(shù)字序列分析對(duì)兩種大蒜總氨基酸測(cè)定方法結(jié)果間的相關(guān)性研究

    2022-03-31 02:07:30擺富葉張婷婷劉睿婷李蘭蘭李喬喬安澤沖李新霞
    關(guān)鍵詞:茚三酮百靈精氨酸

    擺富葉,張婷婷,劉睿婷,2,李蘭蘭,李喬喬,安澤沖,王 巖,李新霞

    (1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊 830011;2新疆大蒜藥用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830013)

    大蒜(Allium SativumL.)為百合科或蔥科蔥屬植物蒜的地下鱗莖,富含多種氨基酸[1-2],具有抗氧化[3-4],保護(hù)肝臟、降低血小板凝集[5]、增強(qiáng)免疫力[6]、抗輻射[7]、抗炎[8-9]、抗腫瘤[10-11]等功效,多用于抗腫瘤治療,其中的精氨酸還具有免疫調(diào)節(jié)及抗氧化功能[12-15]。目前測(cè)定氨基酸的方法主要有光譜法、色譜法和氨基酸分析儀直接分析法[16-17]。光譜法采用茚三酮顯色法測(cè)總氨基酸,其原理是茚三酮將α-氨基酸氧化成亞氨基后水解成氨與還原的茚三酮和茚三酮之間發(fā)生縮合,產(chǎn)生藍(lán)紫色產(chǎn)物,根據(jù)這個(gè)有色反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行可見光譜法定量。在植物中有多種氨基酸,根據(jù)反應(yīng)原理采用一個(gè)氨基酸對(duì)照品為替代,以它計(jì)總氨基酸含量是一個(gè)經(jīng)典的方法,它的優(yōu)點(diǎn)是快速、節(jié)省對(duì)照品,方法的穩(wěn)定性好,易于操作,適用于大樣本量對(duì)總氨基酸含量數(shù)據(jù)有需求的分析測(cè)定。色譜法常采用柱前衍生化,異硫氰酸苯酯(Phenyl isothiocyanate,PITC)為柱前衍生氨基酸分析常用試劑,該法可以測(cè)定每一種氨基酸的具體含量,但操作冗長(zhǎng),檢測(cè)成本較高。氨基酸分析儀只能測(cè)定18種已有對(duì)照品的氨基酸,但特殊氨基酸,如蒜氨酸不包括在內(nèi),且儀器價(jià)格相對(duì)昂貴。數(shù)字序列相關(guān)性分析法[18]是判斷兩個(gè)序列是否具有線性或擬線性關(guān)系的方法。本研究采用茚三酮顯色-可見分光光度法(茚三酮顯色-Vis 法)和PITC 衍生化-HPLC 法(HPLC 法)分別測(cè)定大蒜總氨基酸的含量,采用數(shù)字序列相關(guān)分析法分析兩種測(cè)定方法間的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器LC-2030C 3D Plus 高效液相色譜儀(日本島津公司);UV2550 紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);AB135-S分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

    1.2 試劑對(duì)照品:天冬氨酸(百靈威,批號(hào)L660Q23),谷氨酸(百靈威,批號(hào)LQ80Q22),絲氨酸(百靈威,批號(hào)LD10Q112),甘氨酸(百靈威,批號(hào)L6C0Q29),組氨酸(百靈威,批號(hào)L650Q40),精氨酸(百靈威,批號(hào)L280Q27),蘇氨酸(百靈威,批號(hào)LB50P24),丙氨酸(百靈威,批號(hào)LR40Q23),酪氨酸(百靈威,批號(hào)LT60Q16),纈氨酸(百靈威,批號(hào)L330Q56),苯丙氨酸(百靈威,批號(hào)LG50Q57),蛋氨酸(百靈威,批號(hào)LK70Q23),賴氨酸(百靈威,批號(hào)LR60Q15),天冬酰胺(百靈威,批號(hào)L280Q59),脯氨酸(百靈威,批號(hào)LE30Q108),亮氨酸(百靈威,批號(hào)L210Q38),色氨酸(百靈威,批號(hào)LL90Q74),S-烯丙基-L-半胱氨酸(東京化成,批號(hào)J4ZFO-JK),S-甲基-L-半胱氨酸(東京化成,批號(hào)KNGB J-I C),蒜氨酸(新疆埃樂欣,批號(hào)AL160526),正己烷(天津天新,批號(hào)20180710),茚三酮(中國(guó)醫(yī)藥,批號(hào)20040318),磷酸二氫鉀(天津致遠(yuǎn),批號(hào)2019062059),三乙胺(天津光復(fù),批號(hào)20110509),磷酸氫二鈉(天津致遠(yuǎn),批號(hào)201907205),異硫氰酸苯酯(百靈威,批號(hào)T7530),乙酸鈉(天津福晨,批號(hào)20140804),冰醋酸(天津富宇,批號(hào)20120911),乙腈(美國(guó)Sigma)、甲醇(美國(guó)Sigma)。

    1.3 藥材大蒜于2021年8月-9月購(gòu)買自11個(gè)產(chǎn)地(1-托克遜鄉(xiāng)十大隊(duì)秋播大蒜、2-康其鄉(xiāng)大蒜、3-黑英山五大隊(duì)大蒜、4-托克遜鄉(xiāng)九村秋播大蒜、5-托克遜鄉(xiāng)十大隊(duì)春播大蒜、6-托克遜鄉(xiāng)九村春播大蒜、7-察合哥鎮(zhèn)四大隊(duì)秋蒜、8-托克遜鄉(xiāng)一村春播大蒜、9-托克遜鄉(xiāng)一村秋播大蒜、10-大橋鄉(xiāng)五村大蒜、11-察合哥鎮(zhèn)四大隊(duì)春蒜);大蒜粉于2018 年10 月24 日購(gòu)買自23個(gè)產(chǎn)地(12-甘肅武威(紫皮蒜)、13-青海西寧(獨(dú)頭蒜)、14-河南、15-青海西寧(白蒜)、16-山東(巴里坤種植)、17-甘肅武威(獨(dú)頭蒜)、18-青海西寧(紅蒜)、19-新疆拜城縣、20-新疆昭蘇、21-山東(紫皮蒜)、22-李寨三社、23-新疆且末(大蒜)、24-新疆巴里坤(第一批次)、25-新疆且末(高原香蒜)、26-新疆且末(香蒜)、27-名聯(lián)十二社、28-甘肅酒泉(第一批次)、29-新疆塔城、30-新疆巴里坤(第二批次)、31-新疆三棵樹(第四批次)、32-新疆吉木薩爾、33-甘肅酒泉(第二批次)、34-甘肅民樂),經(jīng)冷凍干燥后獲得大蒜的凍干粉。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 茚三酮顯色-Vis法測(cè)定大蒜總氨基酸的含量

    2.1.1 溶液的配制 磷酸鹽緩沖液的配制(pH8.0):取0.9 %磷酸二氫鉀溶液10 mL 加入2.4 %磷酸氫二鈉溶液190 mL混勻即得。2%茚三酮溶液的配制:稱取2.0 g 茚三酮置于錐形瓶,加入70 mL 蒸餾水溶解,加入氯化亞錫80 mg,過濾,蒸餾水定容至100 mL,備用。氨基酸對(duì)照品溶液的配制:稱定精氨酸對(duì)照品0.1 g 置于50 mL 量瓶中,用蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,即得(每1 mL中約含精氨酸2.0 mg)。

    2.1.2 供試品溶液制備 大蒜經(jīng)凍干粉碎獲得蒜粉,稱取大蒜粉0.5 g 置于50 mL 量瓶中,加5 mL 甲醇超聲10 min,加水定容至刻度,搖勻,離心,取上清液備用。稱取大蒜100 g 于500 mL 的燒杯,加水200 mL煮沸10 min,勻漿,轉(zhuǎn)移至500 mL 容量瓶,加水定容至刻度,離心,取上清備用。

    2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 量取1.0 mL 供試品或?qū)φ掌啡芤?,置?0 mL 具塞試管中,加磷酸鹽緩沖液(pH8.0)至5.0 mL,加1.0 mL 2%茚三酮溶液,80℃水浴30 min,放置室溫,加水至16.0 mL。以相應(yīng)的試劑為空白,測(cè)定567 nm處的吸光度。

    2.1.4 回歸方程的建立 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求量取精氨酸對(duì)照品溶液0、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 和2.0 mL,分別置20 mL 具塞試管中,按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定,以濃度和吸光度分別為橫縱坐標(biāo),建立回歸方程:Y=0.004 2X-0.640 1,r=0.999 5。結(jié)果表 明,在200.00~400.00 μg/mL范圍內(nèi)氨基酸的質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

    2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 量取供試品溶液6 份,按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作,結(jié)果精密度RSD<2%。

    2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作,每隔5 min 測(cè)定1 次已反應(yīng)完畢的供試品溶液,連續(xù)測(cè)定45 min。結(jié)果表明,在45 min 內(nèi)氨基酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度穩(wěn)定。

    2.1.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 按1:1 加入精氨酸對(duì)照溶液(0.3 mg/mL)于供試品溶液(5.002 mg/mL)(n=6)中,按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作,結(jié)果顯示加樣回收率在95.0%~105.0%范圍內(nèi),RSD<2.0%。

    2.1.8 含量測(cè)定分別稱取31 批不同批號(hào)的大蒜樣品(n=3),按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作,測(cè)定567 nm 處吸光度,以精氨酸計(jì)大蒜總氨基酸含量,見表1。

    表1 茚三酮顯色-Vis法和HPLC法測(cè)定31批大蒜總氨基酸含量及數(shù)據(jù)變換結(jié)果

    2.2 HPLC法測(cè)定大蒜總氨基酸的含量

    2.2.1 溶液的配制 對(duì)照品溶液的配制:稱取適量各氨基酸對(duì)照品,加水溶解并稀釋至所需濃度(天冬氨酸:151.44 μg/mL,谷氨酸:146.76 μg/mL,絲氨酸:82.08 μg/mL,甘氨酸:80.96 μg/mL,組氨酸:78.56 μg/mL,精氨酸:1002.14 μg/mL,蘇氨酸:161.04 μg/mL,丙氨酸:159.88 μg/mL,脯氨酸:161.52 μg/mL,酪氨酸:80.44 μg/mL,纈氨酸:149.12 μg/mL,蛋氨酸:131.56 μg/mL,亮氨酸:80.36 μg/mL,苯丙氨酸:148.40 μg/mL,色氨酸:79.52 μg/mL,賴氨酸:151.72 μg/mL,S-烯丙基-L-半胱氨酸:98.28 μg/mL,S-甲基-L-半胱氨酸:80.72 μg/mL,天冬酰胺:98.80 μg/mL),備用。蒜氨酸對(duì)照品溶液的配制:稱取蒜氨酸對(duì)照品適量,用50%甲醇配制成濃度為368 μg/mL的溶液,備用。

    2.2.2 供試品溶液的配制 鮮蒜經(jīng)凍干得蒜粉,取各產(chǎn)地蒜粉100 mg 置于10 mL 容量瓶中,加5 mL 甲醇超聲10 min,用水定容至刻度,即得。大蒜供試品溶液配制見“2.1.2”。

    2.2.3 色譜條件 色譜柱:日本島津VP-ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相A:pH6.5 乙酸鈉溶液(1 000 mL-乙腈70 mL);流動(dòng)相B:甲醇-乙腈-水(20∶60∶20),檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,流速1.0 mL/min,柱溫35℃,進(jìn)樣量10 μL,按流動(dòng)相A:0~5 min,98%;5~6 min,95%;6~14 min,91%;14~18 min,79%;18~32 min,55%;32~34 min,45%;34~38 min,0%,程序洗脫,見圖1。

    圖1 20種氨基酸對(duì)照品HPLC色譜圖

    2.2.4 含量測(cè)定 取供試品溶液,衍生化處理,按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,以外標(biāo)法對(duì)各氨基酸含量進(jìn)行計(jì)算,各氨基酸含量結(jié)果之和為大蒜總氨基酸含量,結(jié)果見表1。

    2.3 建立茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸相關(guān)性數(shù)學(xué)模型采用數(shù)字序列相關(guān)性分析法建立茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸結(jié)果是否具有相關(guān)性的數(shù)學(xué)模型,用相關(guān)系數(shù)Cμ1·μ2、r來(lái)判斷。

    按不同方法分別計(jì)算相關(guān)系數(shù)得:

    式中:Cμ1·μ2,r為相關(guān)系數(shù),μ1、μ2和x、y 為變量,μ1=xi/maxxi,μ2=yi/maxyi),xi和yi分別是茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸含量;maxxi和maxyi分別是茚三酮顯色-Vis法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸含量中的最大值,x和y分別是茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸含量變換結(jié)果。按照Cμ1·μ2相關(guān)程度判定:若|Cμ1·μ2|<0.5,無(wú)明顯相關(guān)性;若|Cμ1·μ2|≥0.9,有相當(dāng)明顯相關(guān)性。按照r相關(guān)程度判定:若0.7≤|r|<1,高度相關(guān);若|r|<0.4,低度相關(guān)。本研究將茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法兩種方法的測(cè)定數(shù)據(jù)按μ1=xi/maxxi,μ2=yi/maxyi進(jìn)行數(shù)據(jù)變換,見表1。將表1 數(shù)據(jù)按照公式(1)和(2)計(jì)算得:Cμ1·μ2=0.921 7,r=0.932 0,表明測(cè)定大蒜總氨基酸含量所采用的茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法具有“相當(dāng)明顯即高度相關(guān)性”,擬合出線性方程:Y=1.003 3X+2.278 1,r=0.932 0,且P<0.01,說明相關(guān)性具有顯著性意義,見圖2。

    圖2 兩法測(cè)定大蒜總氨基酸含量的回歸曲線

    2.4 相關(guān)性數(shù)學(xué)模型的驗(yàn)證隨機(jī)抽取3 批大蒜粉進(jìn)行茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸含量,所得數(shù)據(jù)用本文建立的相關(guān)性數(shù)學(xué)模型分析,驗(yàn)證相關(guān)性數(shù)學(xué)模型的適用性。結(jié)果表明茚三酮顯色-Vis 法測(cè)得的大蒜粉總氨基酸含量測(cè)算HPLC 法測(cè)得的大蒜粉總氨基酸含量,與HPLC 法測(cè)得的大蒜粉總氨基酸含量的真實(shí)值比較,絕對(duì)值誤差較小,說明該相關(guān)性數(shù)學(xué)模型具有較高的適用性,見表2。

    表2 相關(guān)性數(shù)學(xué)模型的驗(yàn)證

    3 討論

    茚三酮顯色-Vis 法的原理是含有伯氨基的氨基酸經(jīng)茚三酮氧化為游離氨,再與茚三酮及還原性茚三酮縮合成藍(lán)紫色產(chǎn)物,根據(jù)該產(chǎn)物的吸收波長(zhǎng)進(jìn)行定量測(cè)定,因此不論氨基酸是何種結(jié)構(gòu),只要含有伯氨基,均可定量轉(zhuǎn)化為游離氨,可以反映含有伯氨基的氨基酸總含量。本研究采用20種氨基酸對(duì)其經(jīng)茚三酮氧化后縮合產(chǎn)物的光譜分別進(jìn)行了掃描,對(duì)縮合反應(yīng)條件進(jìn)行了考察,是穩(wěn)定可靠的,故選擇567 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。但無(wú)法檢測(cè)到脯氨酸和天冬酰胺在567 nm 處的最大吸收峰,因脯氨酸是沒有伯氨基的,與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì);天冬酰胺則因?yàn)榱硗夂粋€(gè)酰胺基可與茚三酮反應(yīng),生成棕色產(chǎn)物。因此任選一種含有伯氨基的氨基酸,就可以采用茚三酮顯色-Vis 法對(duì)總氨基酸進(jìn)行含量測(cè)定。本研究以精氨酸為對(duì)照品,是因?yàn)榫彼崤c蒜氨酸占大蒜總氨基酸含量的80%以上,精氨酸約為總氨基酸的49%,而精氨酸與蒜氨酸相比易獲得、更經(jīng)濟(jì),以精氨酸為對(duì)照品采用茚三酮顯色-Vis 法測(cè)定大蒜總氨基酸是可靠的,缺點(diǎn)是不知道各氨基酸分別是多少。

    茚三酮顯色-Vis 法和HPLC 法測(cè)定大蒜總氨基酸結(jié)果通過數(shù)字序列相關(guān)性分析法建立相關(guān)性數(shù)學(xué)模型,并由茚三酮顯色-Vis 法測(cè)得的大蒜總氨基酸結(jié)果預(yù)測(cè)大蒜總氨基酸結(jié)果,驗(yàn)證數(shù)據(jù)的結(jié)果表明結(jié)果是可行的。HPLC 柱前衍生化可以得到每一種氨基酸(只要有對(duì)照品)的含量,相加后就是總氨基酸含量。對(duì)于大蒜來(lái)說,蒜氨酸是特征氨基酸需要采用HPLC 方法獲得含量,課題組已經(jīng)建立了非衍生化的測(cè)定方法,較為簡(jiǎn)便,如果再采用茚三酮顯色-Vis 法結(jié)合數(shù)學(xué)模型獲得總氨基酸含量,就可以評(píng)價(jià)大蒜氨基酸的情況。經(jīng)HPLC 法測(cè)定脯氨酸和天冬酰胺僅占總氨基酸含量的0.57%,是兩種方法誤差的原因之一,但影響不大。

    本研究從原理和大批量數(shù)據(jù)測(cè)定結(jié)果及數(shù)學(xué)模型分析均顯示測(cè)定大蒜樣品中總氨基酸含量的茚三酮顯色-Vis 法相對(duì)HPLC 法更快速更經(jīng)濟(jì),可以結(jié)合蒜氨酸HPLC 法測(cè)定結(jié)果控制和評(píng)價(jià)大蒜樣品原料的質(zhì)量,本研究采用數(shù)字序列相關(guān)性分析評(píng)價(jià)該方法替代HPLC 柱前衍生化法測(cè)定大蒜總氨基酸的可靠性是有意義的。

    猜你喜歡
    茚三酮百靈精氨酸
    百靈春唱
    寶藏(2020年4期)2020-11-05 06:48:38
    草百靈
    文苑(2020年6期)2020-06-22 08:41:38
    小百靈的家
    兒童繪本(2017年13期)2017-08-09 19:11:18
    海峽科學(xué)(2016年10期)2017-01-13 07:36:00
    我家的“小百靈”
    紙張上汗?jié)撌钟〉娘@現(xiàn)研究
    法制博覽(2016年19期)2016-02-01 05:11:07
    精氨酸聯(lián)合谷氨酰胺腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)燒傷患者的支持作用
    DFO、茚三酮顯現(xiàn)滲透性客體上新鮮汗?jié)撌钟〉谋容^研究
    精氨酸、可樂定、精氨酸聯(lián)合左旋多巴不同激發(fā)試驗(yàn)對(duì)GH分泌的影響
    茚三酮衍生高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定純奶中的甘氨酸含量
    欧美日韩黄片免| 亚洲七黄色美女视频| 久久精品91无色码中文字幕| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美绝顶高潮抽搐喷水| www.自偷自拍.com| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美成狂野欧美在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| av天堂在线播放| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 香蕉丝袜av| 中文字幕人妻熟女乱码| 正在播放国产对白刺激| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 黄频高清免费视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 午夜日韩欧美国产| 此物有八面人人有两片| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲成av人片免费观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产精品综合久久久久久久免费 | 色综合欧美亚洲国产小说| 一级毛片高清免费大全| 亚洲 国产 在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 脱女人内裤的视频| 嫩草影视91久久| 国产午夜精品久久久久久| 后天国语完整版免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 午夜福利高清视频| 91精品三级在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美乱色亚洲激情| 久久国产乱子伦精品免费另类| 嫩草影院精品99| 美女 人体艺术 gogo| 99精品在免费线老司机午夜| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 99国产精品免费福利视频| 日韩大码丰满熟妇| 国产成人av激情在线播放| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲熟妇熟女久久| 国内精品久久久久久久电影| 搞女人的毛片| 两个人免费观看高清视频| 人成视频在线观看免费观看| 伦理电影免费视频| 一区二区三区激情视频| 天堂√8在线中文| 精品欧美国产一区二区三| 九色国产91popny在线| 日本黄色视频三级网站网址| 国产亚洲欧美在线一区二区| 可以在线观看的亚洲视频| 黄色毛片三级朝国网站| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 丝袜美足系列| 免费少妇av软件| 两个人视频免费观看高清| 人妻久久中文字幕网| 亚洲av五月六月丁香网| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 美女 人体艺术 gogo| 色综合婷婷激情| 婷婷精品国产亚洲av在线| 黄色视频,在线免费观看| 女人精品久久久久毛片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产主播在线观看一区二区| 久久九九热精品免费| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲第一青青草原| 黄色片一级片一级黄色片| 在线国产一区二区在线| 久久狼人影院| 久久久久国内视频| 一级毛片女人18水好多| 日韩欧美国产一区二区入口| 黄频高清免费视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美成人午夜精品| 亚洲av日韩精品久久久久久密| x7x7x7水蜜桃| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久天堂一区二区三区四区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产91精品成人一区二区三区| 在线观看午夜福利视频| 中文字幕高清在线视频| 99re在线观看精品视频| 香蕉国产在线看| 真人做人爱边吃奶动态| 国产男靠女视频免费网站| 黄频高清免费视频| 9色porny在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 免费观看人在逋| 亚洲精品国产一区二区精华液| 少妇 在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 天堂动漫精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 岛国在线观看网站| 国产91精品成人一区二区三区| 真人一进一出gif抽搐免费| 一区二区三区国产精品乱码| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 最近最新免费中文字幕在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品影院久久| 视频在线观看一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 亚洲国产看品久久| 99香蕉大伊视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 宅男免费午夜| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美不卡视频在线免费观看 | 精品一品国产午夜福利视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国语自产精品视频在线第100页| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品98久久久久久宅男小说| 成人免费观看视频高清| 久久伊人香网站| 欧美日韩黄片免| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产片内射在线| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品日韩av在线免费观看 | 亚洲成人免费电影在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产激情久久老熟女| 91在线观看av| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲,欧美精品.| 亚洲黑人精品在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲在线自拍视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产麻豆成人av免费视频| xxx96com| 亚洲熟女毛片儿| 长腿黑丝高跟| 校园春色视频在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美日韩乱码在线| 可以在线观看毛片的网站| 国产在线观看jvid| 一进一出抽搐动态| 亚洲专区国产一区二区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲 国产 在线| 大型av网站在线播放| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产99久久九九免费精品| 日本五十路高清| 最近最新免费中文字幕在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美成狂野欧美在线观看| 一本综合久久免费| 国产一区二区激情短视频| 色av中文字幕| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久亚洲真实| 久久 成人 亚洲| 国产一区在线观看成人免费| 三级毛片av免费| 国产精品一区二区精品视频观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产成人av激情在线播放| 午夜福利18| 国产成人影院久久av| 亚洲国产欧美网| 国产亚洲精品第一综合不卡| 91精品三级在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看 | 欧美久久黑人一区二区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久热这里只有精品99| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 大陆偷拍与自拍| 日韩av在线大香蕉| 精品日产1卡2卡| 欧美国产精品va在线观看不卡| av天堂在线播放| 露出奶头的视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 黄片播放在线免费| 欧美精品亚洲一区二区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产成人av教育| 真人做人爱边吃奶动态| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产黄a三级三级三级人| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 人人澡人人妻人| 免费在线观看影片大全网站| 国产精品九九99| 国产激情久久老熟女| www.自偷自拍.com| 99在线视频只有这里精品首页| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲人成77777在线视频| 国产人伦9x9x在线观看| 午夜福利欧美成人| 最新在线观看一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 香蕉丝袜av| 欧美最黄视频在线播放免费| 岛国视频午夜一区免费看| 精品久久蜜臀av无| 婷婷精品国产亚洲av在线| 香蕉国产在线看| 手机成人av网站| 久久久精品欧美日韩精品| 人人澡人人妻人| 一a级毛片在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩中文字幕欧美一区二区| av超薄肉色丝袜交足视频| 精品国产国语对白av| 欧美激情 高清一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| a级毛片在线看网站| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久久国产精品麻豆| 久久人妻av系列| 美女午夜性视频免费| 无人区码免费观看不卡| 少妇粗大呻吟视频| tocl精华| 久久香蕉精品热| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 久久亚洲精品不卡| 中出人妻视频一区二区| 国产野战对白在线观看| 很黄的视频免费| 不卡一级毛片| 两性夫妻黄色片| 曰老女人黄片| 高清黄色对白视频在线免费看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 国产精品久久电影中文字幕| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 精品国产一区二区久久| 国产精品综合久久久久久久免费 | 欧美不卡视频在线免费观看 | av有码第一页| 脱女人内裤的视频| 长腿黑丝高跟| 看免费av毛片| 久久精品影院6| 伦理电影免费视频| 在线永久观看黄色视频| 国产单亲对白刺激| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 人人妻人人澡人人看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日韩大码丰满熟妇| 国产视频一区二区在线看| 狠狠狠狠99中文字幕| netflix在线观看网站| 99在线人妻在线中文字幕| 久久人妻av系列| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 成人三级黄色视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产男靠女视频免费网站| 操出白浆在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 操出白浆在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产麻豆成人av免费视频| 色哟哟哟哟哟哟| 一边摸一边抽搐一进一小说| 99国产精品一区二区三区| or卡值多少钱| 在线国产一区二区在线| 亚洲人成77777在线视频| 一级毛片精品| 亚洲中文av在线| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久天堂一区二区三区四区| 国产精品一区二区在线不卡| 黄片小视频在线播放| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产精品久久久人人做人人爽| 91麻豆av在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 极品人妻少妇av视频| 久久精品91蜜桃| 丝袜人妻中文字幕| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品 国内视频| 亚洲最大成人中文| 国产高清有码在线观看视频 | 午夜福利成人在线免费观看| 国产不卡一卡二| 亚洲成国产人片在线观看| 午夜免费成人在线视频| e午夜精品久久久久久久| www.自偷自拍.com| 免费不卡黄色视频| 午夜福利18| 亚洲免费av在线视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 午夜精品在线福利| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精华一区二区三区| 不卡一级毛片| 在线观看免费午夜福利视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| av福利片在线| 97碰自拍视频| 国产亚洲欧美98| 午夜免费成人在线视频| 首页视频小说图片口味搜索| 搡老岳熟女国产| 性欧美人与动物交配| 欧美日本亚洲视频在线播放| 成年女人毛片免费观看观看9| 午夜影院日韩av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 午夜老司机福利片| 国产野战对白在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产不卡一卡二| 国产亚洲欧美精品永久| 久热这里只有精品99| 色尼玛亚洲综合影院| av视频免费观看在线观看| www.精华液| 婷婷六月久久综合丁香| 国产人伦9x9x在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲在线自拍视频| 国产三级黄色录像| 久久精品国产综合久久久| 99国产综合亚洲精品| 咕卡用的链子| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 电影成人av| 精品福利观看| a级毛片在线看网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 最近最新免费中文字幕在线| 久久精品91蜜桃| 男人操女人黄网站| 亚洲专区中文字幕在线| 国产97色在线日韩免费| 99re在线观看精品视频| 级片在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品高清国产在线一区| 欧美日韩乱码在线| 九色亚洲精品在线播放| 在线观看免费日韩欧美大片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 免费在线观看黄色视频的| 此物有八面人人有两片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 日本 av在线| 在线播放国产精品三级| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲精品美女久久av网站| 看片在线看免费视频| 视频区欧美日本亚洲| 黑人操中国人逼视频| 91av网站免费观看| av免费在线观看网站| 在线观看午夜福利视频| 12—13女人毛片做爰片一| 美女 人体艺术 gogo| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品,欧美在线| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久久久久大精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 夜夜爽天天搞| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久久国产成人免费| 韩国精品一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产av一区二区精品久久| 精品第一国产精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产一级毛片七仙女欲春2 | 国产亚洲精品一区二区www| 51午夜福利影视在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 午夜免费激情av| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产97色在线日韩免费| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 亚洲九九香蕉| 欧美不卡视频在线免费观看 | 夜夜爽天天搞| 亚洲精品国产区一区二| 免费不卡黄色视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲无线在线观看| xxx96com| 久久久精品欧美日韩精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 最近最新免费中文字幕在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 99久久精品国产亚洲精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品第一国产精品| 一个人免费在线观看的高清视频| 美女国产高潮福利片在线看| 久久午夜亚洲精品久久| 乱人伦中国视频| 精品欧美一区二区三区在线| 黄片小视频在线播放| 国产1区2区3区精品| 久久中文字幕人妻熟女| 日韩精品中文字幕看吧| 日本a在线网址| 女同久久另类99精品国产91| 免费在线观看黄色视频的| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 88av欧美| 咕卡用的链子| av有码第一页| www日本在线高清视频| 十八禁人妻一区二区| 999久久久精品免费观看国产| 久久午夜亚洲精品久久| 999精品在线视频| 99精品久久久久人妻精品| 成人国产一区最新在线观看| 操出白浆在线播放| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 美女 人体艺术 gogo| 纯流量卡能插随身wifi吗| 波多野结衣一区麻豆| 女性被躁到高潮视频| 精品免费久久久久久久清纯| 成人精品一区二区免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产成人影院久久av| 色老头精品视频在线观看| 免费观看人在逋| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 一级毛片高清免费大全| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 丰满的人妻完整版| 人妻久久中文字幕网| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美丝袜亚洲另类 | 欧美激情 高清一区二区三区| 一级毛片高清免费大全| 夜夜爽天天搞| 男人舔女人的私密视频| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲熟妇熟女久久| 女性被躁到高潮视频| 午夜精品在线福利| 国产精品久久久av美女十八| 黄色a级毛片大全视频| 久久中文字幕人妻熟女| 中文亚洲av片在线观看爽| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲片人在线观看| 91精品国产国语对白视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品久久久久久精品电影 | 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久久久久久午夜电影| 国语自产精品视频在线第100页| 在线观看免费午夜福利视频| 精品一品国产午夜福利视频| 国产1区2区3区精品| 免费搜索国产男女视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产成人啪精品午夜网站| av有码第一页| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产国语露脸激情在线看| 国产高清激情床上av| 91精品国产国语对白视频| 久久亚洲真实| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产片内射在线| 天天添夜夜摸| 国产亚洲av高清不卡| 夜夜夜夜夜久久久久| 黄片小视频在线播放| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 成年人黄色毛片网站| 亚洲国产精品999在线| 午夜免费鲁丝| 亚洲九九香蕉| 亚洲精品国产区一区二| 成人三级做爰电影| 欧美日本中文国产一区发布| 激情在线观看视频在线高清| 日本一区二区免费在线视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲国产欧美网| 在线观看午夜福利视频| 久久人人精品亚洲av| 九色国产91popny在线| 黄频高清免费视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 校园春色视频在线观看| videosex国产| 在线观看免费视频日本深夜| 成人国语在线视频| 亚洲精品美女久久av网站| 成年版毛片免费区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久中文看片网| 中文字幕精品免费在线观看视频| 香蕉国产在线看| 男人舔女人下体高潮全视频| 丝袜美足系列| 99riav亚洲国产免费| 欧美av亚洲av综合av国产av| 日日夜夜操网爽| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产野战对白在线观看| 看免费av毛片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产三级在线视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 51午夜福利影视在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费 | 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产97色在线日韩免费| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲精品国产区一区二| 精品国产一区二区久久| 一级a爱片免费观看的视频| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品亚洲美女久久久| 最近最新免费中文字幕在线| 国产一区二区三区视频了| 免费在线观看亚洲国产| 日韩精品免费视频一区二区三区| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲中文av在线| 欧美性长视频在线观看| 99riav亚洲国产免费| 亚洲 国产 在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产精品免费一区二区三区在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品卡一卡二卡四卡免费| 色播亚洲综合网| 老汉色∧v一级毛片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产欧美日韩一区二区三| 一级毛片高清免费大全|