電針對兔易損粥樣斑塊內(nèi)PDGF-BB及其受體PDGF-AB影響的研究>*

張洪俠，姜希娟，郭茂娟，張 敏

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.泰安市婦幼保健院，山東 泰安 271000)

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電針對兔易損粥樣斑塊內(nèi)PDGF-BB及其受體PDGF-AB影響的研究>*

張洪俠1，姜希娟1，郭茂娟1，張 敏2△

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.泰安市婦幼保健院，山東 泰安 271000)

目的：觀察電針對動脈粥樣硬化易損斑塊內(nèi)血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)及其受體PDGFR-AB的影響，探討電針穩(wěn)定斑塊的機(jī)制。方法：隨機(jī)將24只實(shí)驗(yàn)兔分為兩組：假手組(8只)、實(shí)驗(yàn)組(16只)。造模方法采用腹主動脈內(nèi)皮球囊拉傷配合高脂飲食以及蝰蛇毒和組胺藥物觸發(fā)的方法建立兔腹主動脈不穩(wěn)定斑塊模型，8周末再次將實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為模型組和電針組，歷經(jīng)12周。采用HE染色觀察斑塊病理形態(tài)學(xué)及新生血管的結(jié)構(gòu)情況；采用免疫組學(xué)法檢測腹主動脈斑塊內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物第八因子相關(guān)抗原(FⅧRag)的變化；采用Western blot技術(shù)檢測PDGF-BB及其受體PDGFR-AB變化。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組多數(shù)以易損斑塊為主，斑塊內(nèi)新生血管以單層內(nèi)皮細(xì)胞為主，而電針組干預(yù)后斑塊相對穩(wěn)定，新生血管周圍的周細(xì)胞增多；Western blot檢測結(jié)果，電針可提高斑塊內(nèi)PDGF-BB、PDGFR-AB蛋白表達(dá)水平，與模型組相比差異有顯著性。結(jié)論：電針具有穩(wěn)定易損斑塊的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)斑塊內(nèi)PDGF-BB、PDGFR-AB表達(dá)、募集更多周細(xì)胞有關(guān)。

電針;易損斑塊;血管新生;血小板源性生長因子

易損斑塊的不穩(wěn)定以致破裂將導(dǎo)致急性心腦血管病的發(fā)生甚至危及生命，因此，穩(wěn)定斑塊是當(dāng)前亟待解決的問題。斑塊內(nèi)新生血管不成熟是導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定的重要原因，重塑斑塊內(nèi)新生血管為穩(wěn)定斑塊提供了新思路。易損斑塊內(nèi)新生血管往往缺乏周細(xì)胞的包繞，管壁通透性升高乃致炎細(xì)胞入侵；血管脆性增加乃致血管破裂，進(jìn)而導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定[1]。因此，實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞對周細(xì)胞的募集是新生血管得以成熟的重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)， PDGF/PDGFR是內(nèi)皮細(xì)胞募集周細(xì)胞的重要通路[2-3]。

電針能夠有效穩(wěn)定斑塊[4]。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，電針對生長因子PDGF-BB及其受體的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用[5]。因此，提出假設(shè)：電針是否是通過提高PDGF-BB、PDGFR-AB表達(dá)，提高周細(xì)胞募集，達(dá)到穩(wěn)定血管的作用。本課題以家兔不穩(wěn)定斑塊動物模型為研究對象，以周細(xì)胞的募集為出發(fā)點(diǎn)，觀察電針對PDGF-BB/PDGFR-AB通路的影響，探討電針促新生血管成熟的機(jī)制，為臨床穩(wěn)定斑塊提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

蝰蛇毒(廣州蛇毒研究所)；組胺；PDGF-BB的ELISA試劑盒(美國 R&D)；球囊擴(kuò)張壓力泵(美國Cordis公司)；球囊(天津市中拓乳膠廠) ；電針治療儀為G6805-2(鑫升牌G6805-2)；膽固醇粉(天津市英博生化試劑有限公司)。

1.2 動物模型的制備及干預(yù)

動物分組及飲食：選取健康雄性日本大耳白兔24只，體質(zhì)量(2.0±0.3)kg，由北京科宇動物飼養(yǎng)中心提供。隨機(jī)進(jìn)行分組：假手術(shù)組8只、實(shí)驗(yàn)組16只。實(shí)驗(yàn)組選用腹主動脈內(nèi)皮球囊拉傷配合高脂飲食以及蝰蛇毒和組胺藥物觸發(fā)的方法建立兔腹主動脈不穩(wěn)定斑塊模型[6]。第8周末對實(shí)驗(yàn)組兔再次隨機(jī)分組：模型組(8只)和電針組(8只)，并且3組實(shí)驗(yàn)動物均改為普通飲食。高脂飼料配方：膽固醇2%、大豆色拉油10%、普通飼料88%。

模型的制備及藥物激發(fā)：將兔固定后進(jìn)行麻醉，選擇兔子右下肢進(jìn)行右股動脈剝離術(shù)?？拷h(yuǎn)心端做動脈切口，并導(dǎo)入預(yù)先套好橡膠帽的4F導(dǎo)管，連接壓力注射泵，推注空氣，然后抽拉，重復(fù)3次，然后結(jié)扎、縫合及局部消毒完成對內(nèi)皮的拉傷術(shù)。動物處死前24h和48h分別給予蝰蛇毒、組胺兩次激發(fā)。蝰蛇毒選擇腹膜下注射, 組胺經(jīng)耳緣靜脈注射。

電針干預(yù)：實(shí)驗(yàn)動物于第8周末開始電針干預(yù)，參照郭義主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]教材，選取足三里和內(nèi)關(guān)穴，采用G6805-2型多通道電針儀。選擇疏密波，頻率16～18次/min，以兔四肢微微抽動為宜的強(qiáng)度，20min/次/日，持續(xù)4周。

取材：實(shí)驗(yàn)?zāi)┻M(jìn)行腹主動脈的取材，把取出約10cm腹主動脈進(jìn)行分段，下端約4cm進(jìn)入福爾馬林固定進(jìn)行HE染色；上端約6cm進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 指標(biāo)觀察及檢測方法

取出的一段腹主動脈經(jīng)固定、包埋、切片后作蘇木精-尹紅(HE)染色，觀察斑塊組織形態(tài)學(xué)及斑塊內(nèi)新生血管的變化。應(yīng)用western blot檢測腹主動脈斑塊中PDGF-BB和PDGFR-AB的蛋白水平的變化。稱取血管組織，剪碎后冰上研磨，加入裂解液M-PerTM，裂解后離心，收集上清液，應(yīng)用Bradford法測定蛋白含量。采用硫酸鎳銨增強(qiáng)的DAB顯色法顯色；凝膠成像系統(tǒng)上掃描分析，蛋白含量以條帶的A值×面積(Int×mm2)表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

光鏡下可見模型組內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)中膜明顯增厚，向管腔內(nèi)凸起，可見巨噬細(xì)胞及各種來源的泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)沉積于內(nèi)膜下；斑塊內(nèi)新生血管多由單個內(nèi)皮細(xì)胞圍成，周圍缺乏周細(xì)胞包繞。電針組內(nèi)膜增厚降低、纖維帽增厚，斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量及炎性細(xì)胞含量減少，新生血管周圍的壁細(xì)胞明顯增多。提示電針有改善新生血管結(jié)構(gòu)、促進(jìn)新生血管成熟、穩(wěn)定易損斑塊的作用。見封三彩圖1。

2.2 斑塊內(nèi)新生血管變化

FⅧRag是新生血管內(nèi)皮的特異性標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，假手術(shù)組腹主動脈內(nèi)膜相對光滑，無斑塊形成，故陽性面積無法統(tǒng)計(jì)。模型組斑塊內(nèi)新生血管周圍可見更多棕黃色顆粒FⅧRag的表達(dá)。電針組分布與模型組一致，但與模型組相比，顯著減少(P<0.05)。見圖2及表1。

表1 FⅧRag免疫組化染色結(jié)果比較

2.3 斑塊內(nèi)PDGF-BB和PDGFR-AB表達(dá)

內(nèi)皮細(xì)胞對周細(xì)胞的募集依賴PDGF-BB/PDGFR-AB通路的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果表明，電針組PDGF-BB、PDGFR-AB表達(dá)高于模型組，相比具有差異(P<0.05)，提示電針可有效穩(wěn)定斑塊，抑制斑塊內(nèi)血腫形成,重塑新生血管結(jié)構(gòu)，上調(diào)周細(xì)胞PDGF-AB受體的表達(dá)。見圖3和表2。

表2 各組PFGF、PFGFR灰度值比較

圖3 各組PDGF-BB、PDGFR-AB表達(dá)情況

3 討論

電針抑制斑塊破裂與促進(jìn)斑塊內(nèi)新生血管成熟有關(guān)。基底膜的形成作為新生血管成熟的標(biāo)志，表現(xiàn)為周細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的募集，形成有周細(xì)胞包繞的穩(wěn)定的血管。研究顯示，PDGF-BB及受體在調(diào)控周細(xì)胞的募集中扮演重要的作用[8]。

PDGF是一種二硫化合物二聚體，由α鏈和β鏈構(gòu)成，PDGF家族成員中尤其PDGF-BB是重要的促血管成熟生長因子， PDGF-BB通過與周細(xì)胞表面的受體PDGFR-AB結(jié)合，募集周細(xì)胞包繞新生血管周圍形成完整的血管結(jié)構(gòu)，起到穩(wěn)定內(nèi)新生血管的作用[9]。PDGF-BB表達(dá)減少將會導(dǎo)致周細(xì)胞密度的顯著下降。研究發(fā)現(xiàn)[10]，研究應(yīng)用PDGF和PDGFR基因敲除后的小鼠作為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新生血管周圍缺乏周細(xì)胞，血管脆性大，易出現(xiàn)出血現(xiàn)象，表明PDGF是血管成熟的重要因子。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組斑塊內(nèi)均有新生血管的出現(xiàn)，電針組新生血管數(shù)量相對較少，相對成熟，并且斑塊破裂少于模型組。本研究采用蛋白免疫印跡法評價斑塊內(nèi)PDGF-BB、PDGFR的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，電針組斑塊內(nèi)PDGF-BB、PDGFR的表達(dá)明顯增加。提示電針可能通過激活PDGF-BB、PDGFR信號調(diào)節(jié)傳導(dǎo)通路，達(dá)到募集周細(xì)胞,促新生血管成熟，進(jìn)而穩(wěn)定斑塊的作用，這可能是電針穩(wěn)定斑塊的機(jī)制之一。

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國家自然基金項(xiàng)目,編號：81102699,81173413。

張洪俠(1978-)，女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向:心腦血管疾病的基礎(chǔ)研究。

△通訊作者：張敏(1973-)，女，主治醫(yī)師，研究方向：心腦血管疾病防治及臨床研究。

R246.6

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1005-0779(2016)10-0087-03

2016-05-15