針刺對腦缺血大鼠外周血miRNA-126和VEGF表達(dá)的干預(yù)作用*

徐 虹，張亞敏，孫 華，陳素輝，王富明，楊 楊

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院，北京 100730)

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實(shí)驗(yàn)研究

針刺對腦缺血大鼠外周血miRNA-126和VEGF表達(dá)的干預(yù)作用*

徐 虹，張亞敏，孫 華△，陳素輝，王富明，楊 楊

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院，北京 100730)

目的：以腦缺血再灌注損傷后外周血清中血管再生相關(guān)信號的表達(dá)為切入點(diǎn)，觀察針刺百會、足三里穴對腦缺血再灌注損傷大鼠外周血miRNA-126和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法：隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、針刺組和藥物組，各組大鼠根據(jù)再灌注后時(shí)間隨機(jī)分為1天、3天、5天和7天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。以右側(cè)大腦中動脈線栓法制備腦缺血再灌注損傷模型。TTC法驗(yàn)證模型成功與否。針刺組為造模成功后在規(guī)定時(shí)間內(nèi)針刺百會和左足三里穴；藥物組為造模成功后腹腔注射依達(dá)拉奉。腹主動脈采血后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測血清miRNA-126的表達(dá)；ELISA法檢測血清VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果： 模型組miRNA-126和VEGF表達(dá)升高，3天時(shí)間點(diǎn)達(dá)高峰，高于同時(shí)間點(diǎn)的針刺組和藥物組；除1天時(shí)間點(diǎn)外，針刺組miRNA-126和VEGF表達(dá)高于同時(shí)間點(diǎn)的藥物組。結(jié)論： 針刺大鼠百會、足三里穴可能通過下調(diào)miRNA-126及VEGF的表達(dá)干預(yù)腦缺血再灌注損傷后血管再生。

針刺；腦缺血；miRNA-126；血管內(nèi)皮生長因子

血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種刺激血管內(nèi)皮生長促進(jìn)血管再生的信號蛋白，當(dāng)血液循環(huán)差或者氧供不足的情況下，血液中的VEGF增多，促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)的建立。近年研究發(fā)現(xiàn)，VEGF增生的血管往往是不成熟的,有增加血管滲透性的風(fēng)險(xiǎn)[1]。在臨床上，VEGF被證明與急性腦梗死病人腦梗死的嚴(yán)重程度正相關(guān)[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類高度保守的非編碼小RNA， miRNAs在缺血性腦血管病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。如miRNA-126在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)并調(diào)控血管生成，對維持血管的完整性及血管生成方面有重要作用。近來研究表明，miRNA-126可正向調(diào)節(jié)VEGF受體-2或VEGF mRNA的表達(dá)[3-4]，促進(jìn)新生血管的形成。而且動物實(shí)驗(yàn)研究表明miRNA-126可能與腦缺血再灌注損傷動物的損傷嚴(yán)重程度正相關(guān)[5]。因此VEGF和miRNA-126可能是腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)后的和腦損傷程度相關(guān)的兩個(gè)重要相關(guān)分子。本實(shí)驗(yàn)采用針刺百會、足三里穴，研究其對腦缺血再灌注損傷后大鼠外周血中血管再生相關(guān)因子VEGF和miRNA-126表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑、材料和儀器

VEGF試劑盒(R&D公司 RRV00，美國 )；RNAlater RNA Stabilization Reagent( Invitrogen，美國)、Trizol LS (Invitrogen 10296-010，美國)；QuantiTect Reverse Transcription Kit(Qiagen 205310，德國)；Rotor-Gene Multiplex PCR Kit (Qiagen 204772，德國)；依達(dá)拉奉注射液(批注文號：國藥準(zhǔn)字H20050280，中國，南京先聲東元制藥有限公司)。主要試驗(yàn)儀器：熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(伯樂CFX96，美國)；普通PCR儀(伯樂 C1000，美國)；低溫離心機(jī)等(ALC，意大利)；標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀(THERMO Multiskan MK3，美國)；長城牌KWD-808Ⅱ全能脈沖電療儀(中國，常州)；漢醫(yī)牌一次性無菌針灸針(中國，天津)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將144只健康雄性SD大鼠分為假手術(shù)組(S)、模型組(M)、針刺組(A)和藥物組(ED)4個(gè)大組，后3組先制作MCAO模型，然后根據(jù)再灌注時(shí)間又分為1天、3天、5天和7天組。假手術(shù)組1天、3天、5天、7天時(shí)間點(diǎn)設(shè)8只大鼠。根據(jù)以往實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，考慮造模動物死亡率，模型組、針刺組及藥物組1天、3天、5天、7天時(shí)間點(diǎn)設(shè)為9只大鼠。最終各個(gè)時(shí)間點(diǎn)存活的模型組、電針組及藥物組均為8只。

1.3 大腦中動脈線栓模型和腦缺血再灌注大鼠制備

參考Longa等[6]的線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。術(shù)前大鼠禁食禁水(12h)，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后將大鼠固定于操作臺，消毒后行頸部正中縱行切口，逐步分離頸部肌肉以及其他組織后暴露右側(cè)頸總動脈，頸內(nèi)動脈和頸外動脈，注意保護(hù)周圍血管神經(jīng)。分離大鼠右側(cè)頸外動脈后結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端，并用纖維剪在頸外動脈上剪一個(gè)口，將標(biāo)有黑色記號的線栓插入頸外動脈。剪斷頸外動脈后調(diào)整線栓方向直至線栓進(jìn)入頸內(nèi)動脈，遇到一定阻力后停止，阻斷右側(cè)大腦中動脈入口，線栓插入長度約為18cm。用細(xì)線固定線栓，縫合后讓大鼠休息。腦缺血2h后緩慢拔出線栓直至看到線栓的黑色標(biāo)記后剪掉線栓。大鼠清醒后自由接觸食物和水。

1.4 實(shí)驗(yàn)處理

模型組：造模成功后，不做進(jìn)一步治療，僅每日給予抓取刺激1次。假手術(shù)組：模擬手術(shù)過程至分離頸內(nèi)、頸外動脈后，不做進(jìn)一步造模，直接縫合組織、皮膚。針刺組：造模成功后的SD大鼠，按照規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，常規(guī)消毒，選用一次性無菌針灸針，針刺百會穴和左側(cè)足三里穴，接脈沖治療儀，采用疏密波，頻率2Hz，強(qiáng)度2mA，以局部肌肉出現(xiàn)收縮為度，每日1次，每次20min。藥物組：造模成功后，腹腔注射依達(dá)拉奉3mg/kg，每日1次。

1.5 血清樣品的提供

實(shí)驗(yàn)大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血于室溫下靜置2h，離心(3500rpm，20min)，分離血清；將血清分裝，于-80℃冰箱存放備用。后室溫冰盒上融解備用。

1.6 免疫吸附法(ELISA)測定大鼠外周血VEGF的水平

稀釋標(biāo)準(zhǔn)品后，室溫溫育2h，洗滌4次，加入抗-VEGF抗體100μl，室溫溫育1h，加鏈酶親和素100μl。后加底物100μl 37℃避光顯色15min。加終止液100μl，終止反應(yīng)。450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測腦缺血大鼠外周血清中miRNA-126的表達(dá)

用Trizol LS提取血清組織樣本中總RNA，然后莖環(huán)引物還是反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反向引物和通用引物擴(kuò)增后，以U6為內(nèi)參基因，伯樂CFX96熒光定量PCR檢測系統(tǒng)檢測miRNA-126在血清中的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃RNA酶失活5min，95℃變性30s，72℃延伸30s，循環(huán)42次。用Primer premier 5等引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。miRNA-126引物設(shè)計(jì)序列如下：Sequence 9-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG-29CGCGTAC莖環(huán)反向引物：GTCGTATCCAGCTCAGGTCG AGGTGATCACTGGATACGACCGCGTAC上游正向引物：ACACTCAGCTGGCATTATTACTTTTGG 27bp 64.7通用反向引物：TCCAGCTCAGGTCGAGGTGATC 22bp 63.7。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 TTC染色情況

假手術(shù)組大鼠(A)雙側(cè)腦組織呈鮮紅色，未見缺血性改變；腦缺血再灌注損傷大鼠(B)右側(cè)腦組織大腦中動脈供血區(qū)域，可見到白色的梗死灶，與鮮紅色的正常腦組織形成對比。驗(yàn)證模型成功。見封三彩圖1。

2.2 實(shí)驗(yàn)各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血清miRNA-126表達(dá)情況

假手術(shù)組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)外周血清miRNA-126少量表達(dá)；除1天時(shí)間點(diǎn)外，腦缺血各組(模型組、針刺組、藥物組)大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)外周血清中miRNA-126表達(dá)顯著升高，針刺組和藥物組的表達(dá)顯著低于模型組(P<0.05)，但是針刺組miRNA-126的表達(dá)高于藥物組(P<0.05)；模型組、針刺組和藥物組的峰值時(shí)間均在3天時(shí)間點(diǎn)。見表1、圖2。

2.3 實(shí)驗(yàn)各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血清VEGF表達(dá)情況

假手術(shù)組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)外周血清VEGF少量表達(dá)；模型組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)外周血清中VEGF表達(dá)顯著升高，針刺組和藥物組的表達(dá)顯著低于模型組(P<0.05)；藥物組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)顯著低于針刺組(P<0.05)；模型組、針刺組和藥物組的峰值時(shí)間均在3天時(shí)間點(diǎn)。見表2、圖3。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清miRNA -126表達(dá)相對定量

表2 各組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)血清VEGF表達(dá)變化

圖2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血清miRNA-126表達(dá)情況

圖3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血清VEGF的表達(dá)情況

3 討論

正常情況下VEGF受體基因僅在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)VEGF受體，且水平甚低，腦缺血、缺氧可激活VEGF/VEGF 受體系統(tǒng)，促使半暗帶血管內(nèi)皮生長因子及其受體表達(dá)明顯上調(diào)。其表達(dá)在實(shí)驗(yàn)性動物模型中腦缺血早期(12～24h)[7-8]或者更早(數(shù)分鐘內(nèi))[9]參與了血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞的增值過程，并且持續(xù)到之后的幾周[7,10]。VEGF是強(qiáng)有力的促血管生長因子之一。一般來說，腦缺血再灌注損傷后血管的增生范圍及程度與缺血邊緣區(qū)血流的改善直接相關(guān)，有利于側(cè)支循環(huán)的形成，最終影響著神經(jīng)元的修復(fù)。但是目前研究認(rèn)為VEGF在急性期誘導(dǎo)的新生血管系統(tǒng)往往不成熟，VEGF劑量依賴的滲透性增加可能消減早期VEGF的腦保護(hù)作用，并有導(dǎo)致腦水腫和加重腦損傷的風(fēng)險(xiǎn)，從而使人對VEGF的腦保護(hù)作用產(chǎn)生了質(zhì)疑。近來研究顯示，血清VEGF水平與腦梗死面積有關(guān)，血清VEGF水平愈高，腦梗死面積愈大[11]。Slevin等[2]觀察了急性腦梗死患者血清不同時(shí)相(在梗死后1、3、7、14天)VEGF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)每一個(gè)時(shí)相患者血清VEGF水平均顯著高于正常對照組。其中大面積腦梗死(面積>4cm2)患者各時(shí)相血清VEGF含量為最高，小面積腦梗死(面積<1.5cm2)各時(shí)相血清VEGF含量為最低，說明了外周血清VEGF的表達(dá)可反映腦缺血損傷情況。

miRNA-126是在內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的一種促進(jìn)血管新生的miRNA，可以調(diào)控血管生成、發(fā)育和再生，是目前報(bào)道的與血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管功能密切相關(guān)的microRNA[12]，且大量表達(dá)于哺乳動物腦中[13]。出芽相關(guān)蛋白-1(Sprouty-related protein-1，SPRED-1)和磷酸肌醇3激酶調(diào)節(jié)亞單位(Phospho-inositol-3kinase regulatory subunit 2，PIK3R2)為miRNA-126的兩個(gè)作用靶點(diǎn)，miRNA-126可直接作用于SPRED-1和PIK3R2，抑制SPRED-1和PIK3R2的表達(dá)，分別表現(xiàn)為通過靶向SPRED-1影響RAS/ERK信號通路，靶向PIK3R2影響 PI3K/AKT信號通路，以增強(qiáng)VEGF的生成[14-16]。此外，研究表明如芯指轉(zhuǎn)錄因子(Kruppel-like transcription factors，klf2a)能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)miRNA-126，激活VEGF依賴的信號通路[17]。通過以上途徑miRNA-126發(fā)揮其對VEGF干預(yù)血管形成和保持完整性的信號通路的促進(jìn)作用。有研究表明，外周血中的miRNA-126可能與腦缺血再灌注損傷動物的嚴(yán)重程度正相關(guān)[3]。

依達(dá)拉奉(Edaravone)已被證實(shí)為一種腦保護(hù)劑，可清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化作用，從而抑制腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷，減輕腦缺血引起的水腫及組織損傷[18]。此外，實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)急性期依達(dá)拉奉與重組組織型纖維蛋白酶原激活劑(rtPA)溶栓治療聯(lián)合應(yīng)用可通過減輕氧化應(yīng)激、減少炎性細(xì)胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)來減緩超早期溶栓治療引起的再灌注損傷，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[19-20]。因此選用該藥作為陽性對照藥物。

針灸作為補(bǔ)充和替代治療腦血管病的手段之一，廣泛應(yīng)用于臨床。針灸具有疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和陰陽、扶正祛邪的作用。針刺可以改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能[21]。根據(jù)針灸經(jīng)絡(luò)理論，百會穴是督脈上的要穴，為督脈與足太陽經(jīng)的交會穴，總督一身之陽，位于頭部巔頂，“頭者神之居”為“精明之府”，具有開竅醒神之功。督脈行于脊里，上行入腦，與肝脈交巔，并從脊里分出，屬腎，因此把腦、肝、腎三臟聯(lián)絡(luò)起來，“病變在腦，首取督脈”為治療腦缺血疾病的首選。足三里穴為足陽明經(jīng)要穴，陽明經(jīng)多氣多血，又“主潤宗筋”，宗筋約束骨骼，利于關(guān)節(jié)運(yùn)動，對中風(fēng)之肢體痿痹不用尤為適宜。同時(shí)胃經(jīng)與足太陰脾經(jīng)互為表里關(guān)系。針刺足三里穴可以調(diào)理脾胃、補(bǔ)中益氣、通經(jīng)活絡(luò)、扶正祛邪之效。 腦缺血后機(jī)體正氣不足，屬于積損正衰，百會和足三里穴對于缺血性腦血管病有正向調(diào)節(jié)作用[22-24]。

本研究結(jié)果顯示，模型組、針刺組、藥物組大鼠外周血清VEGF值高于假手術(shù)組，提示腦缺血缺氧可促進(jìn)VEGF的表達(dá)上調(diào)，大鼠腦缺血再灌注損傷(CIRI)后1天外周血清VEGF開始升高，3天達(dá)高峰，與Marti等[8]研究的腦組織表達(dá)基本一致，進(jìn)一步說明了腦缺血后3天可能為腦組織損傷最嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)。同時(shí)經(jīng)研究證實(shí)與急性腦缺血正性相關(guān)的外周血miRNA-126也同步升高。本實(shí)驗(yàn)顯示針刺組大鼠VEGF及miRNA-126表達(dá)較假手術(shù)組升高，較模型組降低，說明針刺治療可能通過降低VEGF及miRNA-126表達(dá)，減少VEGF劑量依賴增高的血管滲透性，從而緩解CIRI后腦組織的損傷而保護(hù)腦組織。但是其治療效果又不如傳統(tǒng)的腦保護(hù)作用藥物依達(dá)拉奉；但是針刺具有操作簡便、費(fèi)用低廉、無毒副作用等特點(diǎn)。選取針刺百會和足三里這兩個(gè)穴位，可通過下調(diào)外周血中VEGF及miRNA-126表達(dá)減緩腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷后，VEGF和其調(diào)控基因miR-126誘導(dǎo)了不成熟新生血管，血管滲透性增加加重了腦水腫，加重了腦組織損傷，而針刺治療可以有效緩解該損傷，因此為臨床治療缺血性腦血管病進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of Acupuncture on Peripheral Serum Expression of miRNA-126and Vascular Endothelial Growth Factor in Rats with Cerebral Ischemia

XU Hong,ZHANG Ya-min,SUN Hua△,CHEN Su-hui,WANG Fu-ming,YANG Yang

(ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,PekingUnionMedicalCollegeHospital,Beijing100730,China)

Objective：To explore the effect of acupuncture at “Baihui” (GV20) and “Zusanli” (ST36) on the peripheral serum expression of miRNA-126and VEGF in rats with CIRI. Methods：Healthy male Sprague-Dawley rats were randomized into a sham-operated group(S), a model group (M), an acupuncture group(A) and an edaravone group (ED) by using the random digit table. Each group was further randomly divided into 1d, 3d, 5d and 7d subgroups based on the reperfusion times according to the random digit table. In the group (M) and the group (A), CIRI was induced by using the thread occlusion method. TTC staining was used to evaluate the success of models. Electroacupuncture stimulation was applied daily to GV20and left ST36for 20min at the indicated time points after successful operation. Edaravone was given at the indicated time points after successful operation once a day. Serum was sampled for detecting VEGF protein via enzyme-linked immunosorbent assay, and serum miRNA-126was examined by using quantitative PCR.Results：The serum level of miRNA-126and VEGF increased significantly, and the peak expression of the group (M) and the group (A) occurred on the 3rd day. The expression of miRNA-126and VEGF in the group (A) and the group (ED) was lower than that in the group(M) at the same time point (P<0.05), and the expression of miRNA-126and VEGF in group (A) was higher than that in the group(ED) for the time points of 3d, 5d and 7d (P<0.05).Conclusion：Acupuncture therapy has a better effect on alleviating CIRI.The mechanism is related to down-regulating the expression of miRNA-126and VEGF.

Acupuncture;Cerebral ischemia;miRNA-126;Vascular endothelial growth factor

國家自然科學(xué)基金委項(xiàng)目,編號:81574054，81403459。

徐虹(1984-)，女，住院醫(yī)師，2014級中西醫(yī)結(jié)合臨床專業(yè)博士研究生，研究方向：針刺對腦血管病的研究。

△通訊作者：孫華(1957-)，女，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要從事針刺對腦血管病臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

R246.6

A

1005-0779(2016)10-0080-04

2016-05-15