乳桿菌有機酸耐受性及發(fā)酵果蔬汁性能分析

解 寒，劉瑞山，張曉娟，馮婧儀，柴麗娟，陸震鳴，史勁松，許正宏,*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.福建綠泉食品有限公司，福建 漳州 363200；4.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

果蔬乳酸菌發(fā)酵制品由于其獨特的風(fēng)味和益生性能，受到越來越多的關(guān)注。乳酸菌發(fā)酵可以利用果蔬原料中的營養(yǎng)成分，積累乳酸、酯類物質(zhì)等風(fēng)味化合物，賦予發(fā)酵果蔬汁豐富的滋味和香氣感官特征[1-3]；同時，還可以增加果蔬汁中的生物活性物質(zhì)，提高其抗氧化和抗菌等性能[4-6]。與其他發(fā)酵制品類似，果蔬發(fā)酵用的菌種及其發(fā)酵性能決定了發(fā)酵過程的可控程度，并影響了發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)[7-10]，但是很多果蔬原料酸度很高，例如檸檬、百香果等高酸原料中，總酸高達25 g/L，這種高酸的營養(yǎng)條件對乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)生了顯著抑制[11-13]。有機酸通過被動擴散進入細胞質(zhì)，進入胞內(nèi)的有機酸迅速解離，導(dǎo)致胞內(nèi)pH值快速降低，嚴重影響了細胞的生理活性[14]。此外，果蔬原料含有的有機酸種類也很豐富，而檸檬酸、蘋果酸和酒石酸是最常見的3 種有機酸，其他有機酸包括莽草酸、綠原酸和琥珀酸等也在水果中較常見。不同果蔬原料中，有機酸的組成差異非常顯著。不同有機酸由于可電離的氫離子數(shù)、電離平衡常數(shù)以及各種有機酸參與微生物代謝機制的不同，從而導(dǎo)致原料中有機酸種類對乳桿菌的生長的抑制存在顯著差異，因此果蔬原料的發(fā)酵需要考慮菌種的耐酸性能，同時還需要選用針對原料有機酸特點的抗逆菌種。在果蔬生物加工領(lǐng)域中，發(fā)酵性能好、與原料適配的抗逆菌株是決定乳酸菌果蔬發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)鍵。提高乳酸菌果蔬發(fā)酵品質(zhì)，需要充分理解果蔬中不同有機酸對乳酸菌發(fā)酵性能的影響，并針對不同的原料主體有機酸類型和含量特點，開發(fā)系列針對性耐酸菌種，并個性化建立發(fā)酵工藝。

基于果蔬乳酸菌生物加工中存在的上述問題，本研究采用前期實驗室乳桿菌菌種庫中發(fā)酵性能較好的3 株乳酸菌，考察其在添加不同種類和濃度有機酸的MRS（Man Rogosa and Sharpe）培養(yǎng)基中生長性能和發(fā)酵特性，比較其對不同有機酸的耐受性能。在此基礎(chǔ)上，選擇有機酸成分差異顯著的12 種典型果蔬汁進行乳酸菌發(fā)酵，分析它們發(fā)酵前后有機酸組成和含量的變化，以期為不同果蔬原料乳酸菌菌種開發(fā)以及個性化工藝理性制定提供可以借鑒的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LP-D、植物乳桿菌（L. plantarum）LP-F、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）LR-S均由實驗室前期通過傳統(tǒng)固態(tài)釀造食醋醋醅中篩選得到[15-16]，3 株菌均通過16S rRNA序列測序并在NCBI比對后鑒定得出分類學(xué)信息。

蘋果濃縮汁16 °Brix、荔枝濃縮汁36 °Brix、水蜜桃濃縮汁28 °Brix、百香果濃縮汁13 °Brix、檸檬濃縮汁（清汁）2 °Brix、青梅濃縮汁（清汁）4 °Brix、獼猴桃濃縮汁（清汁）4 °Brix、紅葡萄濃縮汁36 °Brix、橙濃縮汁17 °Brix、枸杞濃縮汁18 °Brix、桑葚濃縮汁（顏色過深白利糖度不可計）由福建綠泉食品有限公司提供；芹菜購自超市。

草酸、酒石酸、奎寧酸、丙酮酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸標準品 美國Solarbio公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g、牛肉膏10.0 g、葡萄糖20.0 g、硫酸鎂0.58 g、無水乙酸鈉3.0 g、蛋白胨10.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、硫酸錳0.25 g，加蒸餾水溶解并定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。配制固體MRS培養(yǎng)基時添加瓊脂2%。

添加有機酸的培養(yǎng)基：向100 mL MRS培養(yǎng)基中額外添加7 種有機酸（乳酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、草酸、奎寧酸）至相應(yīng)濃度梯度。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-8000紫外-可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 江蘇環(huán)宇科學(xué)儀器廠；BKQ-B50高壓蒸汽立式滅菌鍋 山東博科科學(xué)儀器有限公司；TH-YJ-1450A/B型凈化工作臺 蘇州華科凈化設(shè)備有限公司；PHS-25型pH計 上海雷磁儀器有限公司；SC-3610低速離心機 安徽中科中佳儀器有限公司；1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將從甘油管拿出的菌株接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)20 h。

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵性能測定

生物量：測定樣品在600 nm波長處的OD值；活菌數(shù)測定：采用伊紅美藍活菌數(shù)快速測定方法；pH值：采用pH計直接測定。

有機酸含量測定：將培養(yǎng)液12 000 r/min離心5 min，取2 mL上清液，分別加入 800 μL 300 g/L硫酸鋅溶液和 800 μL 106 g/L亞鐵氰化鉀溶液振蕩混勻，離心，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾后過 Sep-Pak C18預(yù)處理小柱除色素，為待測樣品。取1 mL各單標及混標樣品過0.22 μm微孔濾膜，為待測標樣。處理后的各樣品等待高效液相色譜進行有機酸分析。色譜條件：色譜柱為Waters Atlantis T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為20 mmol/L NaH2PO4溶液，用磷酸調(diào)pH 2.7；進樣體積10 μL；洗脫速率0.7 mL/min；分離時間20 min；柱溫30 ℃；紫外檢測器波長210 nm。測定用的有機酸標準溶液包括草酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸10 種常見有機酸，且質(zhì)量濃度均為0.10 g/L，通過與有機酸標準溶液的保留時間比對定性。定量采用外標法，將有機酸混合標準樣品在同樣的色譜條件下進樣，繪制各種有機酸質(zhì)量濃度對峰面積的標準曲線。

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵

將3 株乳酸菌以2%接種量接入MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫密閉培養(yǎng)20 h（20 h處于穩(wěn)定期），測定發(fā)酵過程中的生物量、活菌數(shù)、pH值和有機酸組成及含量。

將3 株乳酸菌以2%接種量接入添加不同質(zhì)量濃度有機酸的MRS培養(yǎng)基（表1）中，37 ℃恒溫密閉培養(yǎng)20 h（20 h處于穩(wěn)定期），測定發(fā)酵后的活菌數(shù)和乳酸積累量。

表1 有機酸種類和質(zhì)量濃度Table 1 Types and concentrations of organic acid

1.3.4 果蔬發(fā)酵汁制備

將不同果蔬濃縮汁稀釋3 倍（由于濃縮后得到的是果汁清汁，因此白利糖度較低，但是有機酸含量較原果汁濃度顯著更高，因此稀釋3 倍），和芹菜汁補蔗糖至白利糖度12 °Brix，在105 ℃滅菌5 min，自然冷卻，菌種活化3 次后將菌種以2 %的接種量接入果蔬汁中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h，果蔬濃縮汁處理條件和發(fā)酵條件與企業(yè)實際生產(chǎn)條件一致。

1.3.5 多菌種復(fù)合接力發(fā)酵

多菌種接力發(fā)酵工藝，例如A→B為接種A發(fā)酵至第8小時，讓其充分利用營養(yǎng)生長為優(yōu)勢菌，再接入菌種B，兩株菌協(xié)同發(fā)酵至結(jié)束。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均進行3 次生物學(xué)重復(fù)，采用Graphpad Prism 8進行圖表制作，SPSS 20.0進行差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中生長和發(fā)酵性能的比較

乳酸菌可以使糖類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸等多種有機酸，并且可以增加人體有益菌群、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、抗氧化等多種益生功能[17-22]。課題組前期從固態(tài)釀造食醋醋醅中分離篩選得到多種乳桿菌，優(yōu)選了3 株發(fā)酵性能較好的乳桿菌進行后續(xù)的研究，在MRS培養(yǎng)基中的發(fā)酵性能見圖1。

圖1 3株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中生物量（A）、活菌數(shù)（B）、pH值（C）及乳酸、乙酸積累量（D）的變化Fig. 1 Biomass (OD600 nm) (A), viable cell count (B), pH (C) and acetic acid and lactic acid accumulation (D) of three LAB strains cultured in MRS medium as a function of fermentation time

3 株菌生長OD600nm和活菌數(shù)的趨勢一致，LP-D和LP-F的生長狀況較好，16 h后到達穩(wěn)定期，第20小時OD600nm分別為8.25和7.58，活菌數(shù)分別為9.91×109CFU/mL和9.81×109CFU/mL；而LR-S的生長狀況略差，第20小時OD600nm僅為3.06，活菌數(shù)較LP-D和LP-F低1～2 個數(shù)量級。隨著菌體生長繁殖和有機酸的積累，發(fā)酵前8 h pH值下降迅速，發(fā)酵后期，由于乳酸菌進入穩(wěn)定期，此時pH值下降緩慢直至趨于穩(wěn)定。根據(jù)發(fā)酵前后有機酸的分析，3 株乳酸菌均為異型乳酸發(fā)酵，產(chǎn)乳酸的同時都產(chǎn)生少量乙酸，其中LP-D在MRS培養(yǎng)基中酸積累能力最強，乳酸積累量為20.4 g/L，乙酸積累量為2.3 g/L；LP-F次之，乳酸積累量為17.2 g/L，乙酸積累量為1.7 g/L；LR-S的酸積累能力最弱，乳酸和乙酸積累量分別只有8.7 g/L和0.2 g/L。

2.2 3 株乳酸菌對7 種有機酸耐受性分析

果蔬原料中富含多種有機酸，如蘋果酸在蘋果、水蜜桃等水果中含量豐富，通常質(zhì)量濃度大于10 g/L；檸檬、青梅等果蔬中含有較高的檸檬酸，質(zhì)量濃度高達15 g/L；而獼猴桃、芹菜中含有較高的酒石酸，質(zhì)量濃度達到3～5 g/L。因此，考察不同有機酸添加情況下，乳酸菌的發(fā)酵生長情況，對發(fā)酵工藝和菌種的確定有重要指導(dǎo)意義。本研究選擇了果蔬原料中常見的6 種有機酸，此外，由于乳酸是乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物，因此也作為待考察的有機酸種類。根據(jù)原料中有機酸質(zhì)量濃度范圍，針對性設(shè)置了3 個質(zhì)量濃度梯度（表1），得到不同有機酸對乳酸菌生長和乳酸積累的影響（圖2）。

圖2 MRS培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度7 種有機酸對乳酸菌生長和乳酸積累量的影響Fig. 2 Influence of different concentrations of seven organic acids in MRS medium on the growth of lactic acid bacteria and the accumulation of lactic acid

考察的有機酸對菌株抑制作用非常明顯，不同菌株在同一種有機酸酸脅迫下，生長狀況大不相同，體現(xiàn)了果蔬原料可能對乳酸菌造成的抑制作用非常顯著，而且由于原料的有機酸組成不盡相同而造成的抑制效果差異顯著。LP-D在檸檬酸、琥珀酸和草酸質(zhì)量濃度分別達到15、4.5 g/L和4.5 g/L時，活菌數(shù)有6.9×103、7.4×102、1.9×103CFU/mL，乳酸積累量達到4.2、4.4 g/L和5.6 g/L，而其余2 株菌完全不能生長。LP-F在酒石酸質(zhì)量濃度4.5 g/L時，活菌數(shù)和乳酸積累量分別達到3.6×104CFU/mL和5.3 g/L，而其余兩株菌均不生長。LR-S對大多數(shù)有機酸的耐受性都較差，然而，在蘋果酸和奎寧酸的脅迫下，體現(xiàn)出了較另外兩株菌更加優(yōu)良的抗逆性能。這些結(jié)果體現(xiàn)出了不同乳酸菌和不同有機酸之間存在顯著的互相選擇關(guān)系，針對性選擇適配抗逆菌種對果蔬發(fā)酵非常重要。

2.3 12 種典型果蔬汁中3 株乳酸菌的發(fā)酵性能比較

上述結(jié)果體現(xiàn)不同菌株對各種有機酸的耐受性能也存在顯著差異，因此，準確測定果蔬原料中有機酸的種類和含量對菌種選用以及提升果蔬發(fā)酵品質(zhì)具有重要意義。選擇12 種有機酸比較典型的果蔬，將其分為4 類：1）蘋果酸為主體酸（蘋果汁、荔枝汁和水蜜桃汁）[23-25]；2）檸檬酸為主體酸（百香果汁、檸檬汁和青梅汁）[26-28]；3）酒石酸為主體酸（芹菜汁、獼猴桃汁和紅葡萄汁）[29]；4）復(fù)合有機酸的果蔬原料（橙汁、桑椹汁和枸杞汁）[30-31]。通過比較不同菌株對這4 類原料的發(fā)酵性能，進一步確定針對不同原料的適配性菌種，發(fā)酵結(jié)果見圖3。

圖3 12種不同果蔬汁原汁以及分別由3 株乳酸菌發(fā)酵后有機酸含量Fig. 3 Organic acid concentrations of 12 fruit and vegetable juices before and after fermentation by three strains of lactic acid bacteria, separately

3 株乳酸菌均是異型乳酸發(fā)酵，發(fā)酵后的各類果汁中均積累了少量乙酸（均低于0.3 g/L）。蘋果酸、檸檬酸、酒石酸和琥珀酸發(fā)酵后含量全部下降，這與乳酸菌的代謝特性有關(guān)：蘋果酸在蘋果酸-乳酸酶的催化下發(fā)生脫羧反應(yīng)生成乳酸[32]；檸檬酸可以被乳酸菌利用生成乳酸、乙酸和雙乙酰等產(chǎn)物；酒石酸能夠被乳酸菌降解生成乳酸和乙酸[33]；琥珀酸在碳代謝途徑中，可通過丙酮酸氧化為氫離子和乙酸，也可產(chǎn)生少量乳酸[34]。發(fā)酵結(jié)束后，上述有機酸有不同程度的降低，而乳酸得到大量積累。乳酸積累量是評價果蔬發(fā)酵品質(zhì)的重要指標[35]，但是同時也需要兼顧其他有機酸的降低情況，例如檸檬酸、蘋果酸在原料中的降低，會使發(fā)酵后的產(chǎn)品酸感柔和，刺激性減少，這是許多發(fā)酵果蔬產(chǎn)品追求的風(fēng)味特征，科學(xué)選擇針對性的菌種，可以對這一品質(zhì)實現(xiàn)有效控制。

圖4 3株乳酸菌發(fā)酵果蔬后的主體有機酸消耗量以及乳酸積累量Fig. 4 Consumption of major organic acids and lactic acid accumulation in 12 fruit and vegetable juices fermented by three strains of lactic acid bacteria, separately

3 株乳酸菌發(fā)酵果蔬后的主體有機酸消耗量以及乳酸積累量見圖4。高蘋果酸果蔬原料發(fā)酵后，蘋果酸含量下降了50%～100%，其中LR-S對蘋果酸的利用率顯著優(yōu)于（P＜0.05）其余2 株菌，荔枝汁中20.9 g/L的蘋果酸甚至被LR-S全部利用完，乳酸積累量也顯著高于其余兩株菌（P＜0.05）。高檸檬酸果蔬原料中，LP-D對檸檬酸的利用率和乳酸積累量顯著優(yōu)于其余兩株菌（P＜0.05），在百香果汁、檸檬汁和青梅汁中乳酸積累量分別有2.2、3.9 g/L和3.6 g/L，而LR-S在百香果汁和青梅汁的高檸檬酸酸脅迫下，甚至不積累乳酸。高酒石酸果蔬原料發(fā)酵后，LP-F在芹菜汁和紅葡萄汁中對酒石酸的利用率和乳酸積累量顯著優(yōu)于（P＜0.05）其余兩株菌。

3 株微生物在果蔬原料發(fā)酵的比較結(jié)果與在標準MRS培養(yǎng)基中分析得到的3 株微生物對不同有機酸脅迫的響應(yīng)結(jié)果一致。說明菌株對不同有機酸的耐受性能為果蔬原料針對性菌種的選擇提供依據(jù)。

2.4 雙菌順序接種發(fā)酵工藝在復(fù)雜有機酸果蔬原料中的應(yīng)用

上述幾種原料均以單一有機酸為主體酸，其他有機酸含量很少或沒有。發(fā)酵這類原料的關(guān)鍵是選用具有針對性耐受性能的菌株。然而，橙汁、桑葚汁和枸杞汁這類原料，具有1 種以上的主體有機酸，在多重有機酸脅迫下，選擇具有不同有機酸耐受性能的菌種，根據(jù)對乳酸菌的脅迫來源，理性制定多菌種順序發(fā)酵工藝，利用接種的第1株菌解除/降低脅迫壓力，再利用第2株菌高效進行生物轉(zhuǎn)化，理論上較單一菌株發(fā)酵更具優(yōu)勢。具體而言，本研究開發(fā)的多菌種接力發(fā)酵工藝為先將菌株1以1%的接種量接種于果蔬汁中發(fā)酵8 h，讓其充分利用營養(yǎng)生長為優(yōu)勢菌，消耗掉部分有機酸，減少多重酸脅迫對菌株生長的抑制，再以1%的接種量將菌株2接入果蔬汁中接力發(fā)酵直至結(jié)束，結(jié)果見圖5。

圖5 雙菌順序接種發(fā)酵工藝發(fā)酵桑葚汁、橙汁和枸杞汁后主體有機酸消耗量（A）、活菌數(shù)（B）和各有機酸含量（C）Fig. 5 Consumption of major organic acids (A), viable bacterial count (B) and organic acid concentrations (C) after the fermentation of mulberry juice, orange juice and Chinese wolfberry juice by sequential inoculation of two strains

從圖5可以看出，在橙汁中，前8 h活菌數(shù)沒有差別，10 h后LP-D→LR-S的活菌數(shù)迅速增加，高于其他工藝，在24 h活菌數(shù)達到最高2.5×108CFU/mL，其對檸檬酸和蘋果酸的利用率也高于其他工藝，乳酸積累量最高，達到6.4 g/L，比LP-D發(fā)酵后提高了1.5 倍。這是因為LP-D在蘋果酸和檸檬酸的雙重酸脅迫下先成為優(yōu)勢菌株，消耗掉部分檸檬酸，減少LR-S面對的檸檬酸酸脅迫，更有利于后續(xù)LR-S生長，積累乳酸。桑葚汁中，LP-D→LP-F發(fā)酵性能最佳，24 h后活菌數(shù)始終高于其他工藝，酒石酸和檸檬酸的消耗量都高于其他組合，乳酸積累量最多，達到5.6 g/L，比LP-D單菌發(fā)酵提高了1.4 倍。這是由于在整個發(fā)酵過程中LP-D和LP-F充分利用其優(yōu)勢，不斷消耗檸檬酸和酒石酸，協(xié)同發(fā)酵。枸杞汁中，LP-F→LP-D組合在24 h后活菌數(shù)高于其他工藝，酒石酸、蘋果酸、檸檬酸的消耗量均高于其他工藝，分別消耗了0.5、1.6、4.0 g/L，乳酸積累量也顯著高于其他組合，達到5.5 g/L。這是由于在酒石酸、蘋果酸和檸檬酸含量都豐富的情況下，先接種LP-F消耗掉較多的檸檬酸，使后續(xù)的LP-D能在較溫和的條件下發(fā)酵，積累乳酸和生物量。因此，分析不同原料的有機酸特點，根據(jù)不同菌種的耐受特性，開發(fā)個性化的多菌種發(fā)酵工藝，是乳酸菌發(fā)酵果蔬的高效策略。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同乳酸菌對各類有機酸耐受性具有顯著差異，因此需要選用針對性的抗逆菌種進行發(fā)酵。其中LP-D對乳酸、檸檬酸、琥珀酸和草酸的耐受性更好，LP-F在酒石酸的酸脅迫下生長得更好，而LR-S更耐受蘋果酸和奎寧酸的酸脅迫；在12 種典型有機酸果蔬中，LP-D、LP-F和LR-S分別適用于高檸檬酸、高酒石酸和高蘋果酸類的果蔬原料，這些特性與菌種在MRS培養(yǎng)基中有機酸耐受性能一致。但在橙汁、桑葚汁和枸杞汁這類有機酸復(fù)雜果蔬汁中，單一菌種由于耐受性能不全面導(dǎo)致發(fā)酵程度不高。針對橙汁、桑葚汁和枸杞汁這類有機酸復(fù)雜果蔬汁建立了雙菌順序接種發(fā)酵工藝，分別是LP-D→LR-S、LP-D→LP-F、LP-F→LP-D組合的發(fā)酵特性最佳，體現(xiàn)了復(fù)合菌種對多重有機酸的抗脅迫能力更強。本研究建立基于菌種耐受性分析的發(fā)酵菌種選擇策略以及雙菌順序接種發(fā)酵工藝，對提高果蔬發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)以及發(fā)酵過程的控制提供了參考。