酵母菌與乳酸菌發(fā)酵馬乳產(chǎn)ACE抑制肽

唐 蓉，王 康，郭元晟，劉彥敏，孫建萍，朱建軍,*，伊日布斯,*

（1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院生物工程研究院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000）

高血壓是最常見的心血管慢性疾病，往往會(huì)導(dǎo)致心臟病、腦卒中、腎衰等多種并發(fā)癥且具有高死亡率[1]。酸馬乳是北方游牧民族的傳統(tǒng)飲品，以新鮮馬乳為原料，經(jīng)乳酸菌和酵母菌等微生物自然發(fā)酵而成的一種具有獨(dú)特香氣的酸性含醇發(fā)酵乳。酸馬乳在臨床研究中對(duì)高血脂、高血壓、冠心病等心血管疾病具有顯著療效[2-3]，蒙古族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究報(bào)道酸馬乳具有降壓療效，被建議作為治療高血壓的輔助藥物[4-5]，但其降壓機(jī)制仍不清楚。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）是重要的血壓調(diào)節(jié)酶，該酶通過將血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素II收縮血管，以及使緩激肽失活，導(dǎo)致血壓升高[6]。抑制ACE可以抑制血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素II和提升血管舒張緩激肽的活性，從而達(dá)到調(diào)節(jié)血壓的效果[7]。ACE是篩選降血壓藥物的重要靶點(diǎn)，并且ACE抑制劑已經(jīng)是臨床上常用的降血壓藥物。

食源性ACE抑制肽由于安全性高、來源廣泛、無毒副作用而成為高血壓防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其中發(fā)酵乳的研究更為廣泛[8]。發(fā)酵乳不僅是易消化的蛋白質(zhì)來源，還具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和廣泛的生物活性成分，尤其是抗高血壓活性肽[9]。自1995年Nakamura等[10]從Calpis中分離得到具有抑制ACE活性的三肽VPP和IPP能降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓后，越來越多的研究者從發(fā)酵乳中分離得到具有抑制ACE活性的小分子肽[11-14]。但是目前發(fā)酵乳抗高血壓活性的研究大多都使用乳酸菌發(fā)酵，利用酵母菌或乳酸菌與酵母菌共發(fā)酵的研究卻比較少。酵母菌是傳統(tǒng)發(fā)酵乳中常見的微生物類群，例如在開菲爾、酸馬乳、酸駝乳等傳統(tǒng)發(fā)酵乳中酵母菌的數(shù)量可達(dá)106CFU/mL[15]，它不僅可為發(fā)酵乳賦予獨(dú)特的風(fēng)味特征，而且還能水解乳蛋白產(chǎn)生活性肽[16]。酵母菌在乳中生長(zhǎng)或發(fā)酵時(shí)，利用其自身的蛋白水解系統(tǒng)，將乳蛋白降解成小肽和氨基酸供給自身需要的氮源，同時(shí)釋放生物活性肽，已有研究報(bào)道從酵母菌發(fā)酵的脫脂乳中分離純化出ACE抑制肽VLSRYP和LRFF[17]。本研究從傳統(tǒng)酸馬乳中分離純化并篩選出具有ACE抑制活性的乳酸菌與酵母菌，旨在通過共發(fā)酵馬乳生產(chǎn)和純化具有ACE抑制活性的生物活性組分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌株

鮮馬乳采自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟，－20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｋ镁昃鶑膬?nèi)蒙古錫林郭勒盟傳統(tǒng)酸馬乳樣品中分離純化所得，－80 ℃保存。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母膏、MRS肉湯、瓊脂、兩性霉素B中國(guó)Solarbio公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基 上海陸橋有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；馬尿酸（色譜級(jí)）、ACE（源自兔肺）、馬尿酸-組氨酰-亮氨酸（hippuryl-L-histidyl-L-leucine，HHL）、乙腈（色譜級(jí)）、鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA） 德國(guó)Sigma公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PH104A恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；4802UV/VIS紫外-可見光分光光度計(jì) 優(yōu)尼科儀器有限公司；THZ-072HT控溫?fù)u床 上海申能博彩生物科技有限公司；ABI2700聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Applied Biosystem公司；Sartorius PB-10型pH計(jì) 上海珂淮儀器有限公司；Heraeus Fresco 17R臺(tái)式低溫高速離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器） 日本島津公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)美國(guó)GE Healthcare公司；冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬乳發(fā)酵

發(fā)酵劑制備：－80 ℃冰箱中取出菌株，乳酸菌于MRS液體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)；酵母菌于酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，均活化2 代后生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期使用。將活化好的菌液于4 000×g、4 ℃離心5 min，棄去上清液，用預(yù)先滅菌的生理鹽水重復(fù)清洗菌體3 次，收集菌體。最后懸浮于與培養(yǎng)液同體積的無菌生理鹽水中，制成菌懸液作為母發(fā)酵劑。

發(fā)酵：鮮馬乳95 ℃、5 min滅菌后冷卻至37 ℃。滅菌后的馬乳分別接種體積分?jǐn)?shù)4%乳酸菌、4%酵母菌和各2%的乳酸菌和酵母菌，混合1 min。接種乳酸菌的馬乳置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱；接種酵母菌的馬乳置于30 ℃、150 r/min搖床。發(fā)酵乳一式3 份進(jìn)行。

1.3.2 菌株的鑒定

對(duì)篩選出的乳酸菌和酵母菌進(jìn)行16S rRNA和26S rRNA分子生物學(xué)鑒定，表1為PCR擴(kuò)增引物序列。PCR采用25 μL體系：10×PCR Buffer 2.2 μL；dNTPs（2.5 mmol/L）2.5 μL；ddH2O 17.5 μL；上下游引物（10 μmol/L）分別為0.5 μL；DNA模板1 μL；Taq酶0.5 μL。16S rRNA的PCR設(shè)定程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸75 s，共30 個(gè)循環(huán)；26S rRNA的PCR設(shè)定程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；使用無菌的ddH2O作為陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經(jīng)純化回收后交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification

1.3.3 pH值和活菌數(shù)的測(cè)定

pH值測(cè)定：使用pH計(jì)?；罹鷶?shù)測(cè)定：乳酸菌涂布于MRS固體培養(yǎng)基后37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d；酵母菌涂布于PDA固體培養(yǎng)基后28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d。每個(gè)樣品測(cè)定3 個(gè)平行。

1.3.4 水溶性提取物的制備

樣品發(fā)酵結(jié)束后，用1 mol/L的HCl溶液將其pH值調(diào)至4.3，10 000×g離心10 min后收集上清液，再用1 mol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0后，于10 000×g再次離心10 min并收集上清液，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后保存于－20 ℃冰箱，用于下一步分析。

1.3.5 蛋白水解度的測(cè)定

采用OPA法[18]測(cè)定游離氨基含量估算蛋白質(zhì)水解度，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的絲氨酸質(zhì)量濃度表示OPA指數(shù)，即水解度。

樣品測(cè)定：1 mL發(fā)酵馬乳樣品中加入0.5 mL蒸餾水混勻，再加入2.5 mL 0.75 mol/L三氯乙酸溶液混勻，靜置10 min后5 000×g、4 ℃離心10 min，留上清液備用。取400 μL上清液與3 mL的OPA試劑混勻，室溫避光反應(yīng)2 min后，在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，對(duì)應(yīng)絲氨酸質(zhì)量濃度表示蛋白水解度，每個(gè)樣品測(cè)定3 個(gè)平行。

標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：分別配制質(zhì)量濃度為0.025、0.05、0.075 mg/mL和0.1 mg/mL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。400 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到3 mL OPA試劑中，混合均勻，室溫靜置2 min后，在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蒸餾水作空白對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=8.026X－0.004 796（R2=0.999），X表示絲氨酸質(zhì)量濃度（mg/mL），Y表示340 nm波長(zhǎng)處吸光度。

1.3.6 ACE抑制率的測(cè)定

參考Mao Xueying等[19]的方法，進(jìn)行修改后使用HPLC法測(cè)定樣品的ACE抑制活性。HHL溶解于含300 mmol/L NaCl的100 mmol/L硼酸鈉緩沖液中（pH 8.3）。40 μL發(fā)酵馬乳提取物和100 μL HHL（10 mmol/L）在37 ℃溫育10 min后加入40 μL 0.01 U/mL ACE 37 ℃反應(yīng)30 min，煮沸10 min終止反應(yīng)。加入400 μL去離子水，10 000×g離心5 min，經(jīng)過0.45 μm水系過濾器過濾樣品，上樣20 μL進(jìn)行HPLC分析，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行反應(yīng)。HPLC檢測(cè)條件：分析柱Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：25%乙腈-75%水，含0.1%三氟乙酸；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；228 nm監(jiān)測(cè)洗脫；結(jié)束時(shí)間10 min。根據(jù)馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品產(chǎn)生的馬尿酸的質(zhì)量濃度。ACE抑制率按下式計(jì)算：

式中：Ca為緩沖液代替樣品進(jìn)行反應(yīng)的馬尿酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Cb為樣品反應(yīng)后產(chǎn)生的馬尿酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Cc為緩沖液代替ACE進(jìn)行反應(yīng)的馬尿酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析發(fā)酵產(chǎn)物的組成

選用5%濃縮膠和12%分離膠對(duì)鮮馬乳和發(fā)酵馬乳中的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE，在0.5 mol/L pH 6.8 Tris-HCl和1.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl緩沖液中運(yùn)行2 h分離。隨后將蛋白質(zhì)在含有0.1 g/100 mL考馬斯亮藍(lán)R-250、40%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇、50%水和10%乙酸的混合溶液中染色過夜。染色結(jié)束后在沒有考馬斯亮藍(lán)R-250的溶液中脫色，使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)脫色好的凝膠進(jìn)行拍照并保存。

1.3.8 反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分析發(fā)酵產(chǎn)物組成

根據(jù)Vincenzetti等[20]的方法作修改，對(duì)鮮馬乳和發(fā)酵馬乳蛋白和多肽組成進(jìn)行RP-HPLC分析。樣品處理：發(fā)酵乳加2 倍體積CL Buffer，混勻后室溫下靜置5 min，4 000×g離心15 min，0.45 μm濾膜過濾后取20 μL上樣。色譜條件：色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，100 ?）；流動(dòng)相A：0.1% TFA溶液，流動(dòng)相B：0.1% TFA-乙腈溶液；進(jìn)樣量20 μL；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；檢測(cè)溫度30 ℃；洗脫程序：0～5 min，95% A、5% B；5～40 min，95%～20% A、5%～80% B；40～50 min，20%～95% A、80%～5% B；50～70 min，95% A、5% B；70 min停止。

1.3.9 發(fā)酵產(chǎn)物的體外模擬胃腸消化

參照Alting等[21]的方法并稍作修改。首先，將馬乳發(fā)酵產(chǎn)物溶于蒸溜水中配成3 g/100 mL溶液，加入胃蛋白酶，酶與底物質(zhì)量比為1∶50，用1 mol/L HCl溶液將其pH值調(diào)至2，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后，啟動(dòng)體外胃模擬消化，37 ℃酶解60 min；用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7，加入胰蛋白酶，酶與底物質(zhì)量比為1∶50，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后，啟動(dòng)體外腸道模擬消化，保持pH 7，37 ℃酶解120 min，整個(gè)水解過程中持續(xù)攪拌。酶解結(jié)束后沸水浴5 min，滅活蛋白酶。水解液1 800×g、4 ℃離心10 min，收集上清液，真空冷凍干燥后于－20 ℃保存。

1.3.10 AKTA葡聚糖G-25凝膠色譜分離ACE抑制肽

將SephedaxG-25凝膠浸泡充分溶脹后裝入層析柱中，預(yù)先用蒸餾水沖洗柱子使其平衡至基線平穩(wěn)。樣品凍干粉溶于蒸餾水中，過0.45 μm濾膜，配成100 mg/mL，取10 mL上樣于層析柱，采用0.5 mL/min的蒸餾水洗脫，220 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，人工收集洗脫液。合并后的分離峰冷凍干燥制成凍干粉，蒸餾水溶解配成不同濃度，分別測(cè)定各分離峰的抑制率。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Graphpad Prism8.2.1軟件進(jìn)行計(jì)算繪圖；響應(yīng)面使用Mintab19進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析；并使用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果以表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株的篩選與鑒定

從傳統(tǒng)酸馬乳樣品中分離獲得乳酸菌234 株，酵母菌102 株，在馬乳中進(jìn)行發(fā)酵，乳酸菌在馬乳中生長(zhǎng)代謝良好則可大量產(chǎn)酸，降低乳環(huán)境的pH值，以pH值作為篩選乳酸菌的條件，在37 ℃條件下馬乳中培養(yǎng)24 h，pH值降至5.0以下的乳酸菌株10 株。酵母菌在馬乳中生長(zhǎng)代謝良好則活菌數(shù)的較多，菌液的OD600nm值較高，以酵母菌生長(zhǎng)的OD600nm值為指標(biāo)篩選出在30 ℃、150 r/min條件下馬乳中培養(yǎng)24 h，OD600nm值增至1.5以上的酵母菌8 株。

對(duì)以上發(fā)酵性能良好的乳酸菌和酵母菌分別進(jìn)行16S rRNA和26S rRNA測(cè)序，利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序進(jìn)行序列相似性的比對(duì)，結(jié)果如表2、3所示。進(jìn)而對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖1所示，菌株L1、L3、L4、L6、L7、L9、L10聚類于乳桿菌屬（Lactobacillus），L1與乳酸桿菌（L. diolivorans）的同源性為100%，L3與副干酪乳桿菌（L. paracasei）的同源性為99.26%、L4與乳桿菌（Lactobacillus）的同源性為98.47%，L6、L9與嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）的同源性大于97%，L7、L10與植物乳桿菌（L. plantarum）的同源性大于98%。菌株L2與腸球菌屬（Enterococcus）的杜蘭腸球菌（E. durans）同源性為99.15%；菌株L5和L8聚類于乳球菌屬（Lactococcus），與乳酸乳球菌（L. lactis）的同源性大于98%。酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖2所示，菌株Y1、Y2、Y6聚類于畢赤酵母屬（Pichia），Y1與發(fā)酵畢赤酵母（P. fermentans）的同源性為99.63%，Y2、Y6與庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（P. kudriavzevii）的同源性大于99%；菌株Y3、Y8聚類于克魯維酵母屬（Kluyveromyces），與馬克思克魯維酵母（K.marxianus）的同源性為100%；菌株Y4與哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）的薩克斯坦單胞釀酒酵母（K.unispora）的同源性為99.63%；菌株Y5與釀酒酵母屬（Saccharomyces）的釀酒酵母（S. cerevisiae）同源性為99.65%；菌株Y7與耶氏酵母屬（Yarrowia）的解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）同源性為100%。

表2 乳酸菌鑒定結(jié)果Table 2 Identification of lactic acid bacteria

表3 酵母菌鑒定結(jié)果Table 3 Results of yeast identification

圖1 乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria

圖2 酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogenetic tree of yeast

2.2 ACE抑制活性乳酸菌的篩選

表4 乳酸菌發(fā)酵馬乳篩選結(jié)果Table 4 Properties of fermented milk with lactic acid bacteria

以上篩選出的10 株乳酸菌在馬乳中生長(zhǎng)發(fā)酵能力具有差異，如表4所示，所用菌株發(fā)酵馬乳的ACE抑制率均高于原馬乳的5.19%，其中ACE抑制率最高的為L(zhǎng)8，抑制率可達(dá)到37.33%，其水解度最大可達(dá)0.24 mg/mL，pH值為4.38，活菌數(shù)為6.36（lg（CFU/mL））。所用乳酸菌發(fā)酵馬乳pH值均降至5以下，發(fā)酵60 h L4菌株的活菌數(shù)最多為9.16（lg（CFU/mL）），L8菌株發(fā)酵60 h活菌數(shù)最少為6.36 （lg（CFU/mL））。L7和L8對(duì)馬乳蛋白的水解度相同為0.24 mg/mL；L6和L9的蛋白水解能力適中，水解度分別可達(dá)0.13 mg/mL和0.10 mg/mL；其他菌株發(fā)酵馬乳的蛋白水解度都小于0.10 mg/mL。

2.3 ACE抑制活性酵母菌的篩選

篩選獲得的8 株酵母菌在馬乳中的生長(zhǎng)發(fā)酵也具有較大差異，如表5所示，其中Y2和Y6發(fā)酵馬乳ACE抑制率低于原馬乳的5.19%，其他菌株發(fā)酵馬乳的ACE抑制率均高于原馬乳，其中ACE抑制率最高的是Y7，抑制率可達(dá)到51.17%，其水解度最大可達(dá)0.22 mg/mL，pH值可降至5.70，活菌數(shù)為6.75（lg（CFU/mL））。在發(fā)酵60 h Y8菌株的活菌數(shù)最多為8.36（lg（CFU/mL）），Y6菌株的活菌數(shù)最少為6.65（lg（CFU/mL））。所測(cè)酵母菌發(fā)酵馬乳的pH值除Y7外其他沒有明顯下降。Y7的蛋白水解能力最強(qiáng)，最大水解度可達(dá)0.22 mg/mL，是其他菌株的4 倍以上，其他菌株之間的水解度差異不顯著。

表5 酵母菌發(fā)酵馬乳篩選結(jié)果Table 5 Properties of fermented milk with yeast

2.4 不同因素對(duì)乳酸菌與酵母菌共發(fā)酵馬乳ACE抑制活性的影響

為考察乳酸菌和酵母菌組合發(fā)酵馬乳的ACE抑制活性，選擇ACE抑制率最高的乳酸菌L8和酵母菌Y7進(jìn)行組合發(fā)酵，并測(cè)試發(fā)酵條件對(duì)乳酸菌和酵母菌共發(fā)酵馬乳ACE抑制率的影響。如圖3所示，不同接種比例發(fā)酵馬乳的ACE抑制率均為60%左右，經(jīng)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著差異（P＞0.05），因此后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中無考慮該因素。隨著接種量的增加，發(fā)酵馬乳ACE抑制率先增加后降低，接種量為6%時(shí)ACE抑制率達(dá)到最大為70%；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵馬乳ACE抑制率先增加后降低，發(fā)酵60 h ACE抑制率達(dá)到最大值70.3%；隨著溫度升高，發(fā)酵馬乳中ACE抑制率的變化趨勢(shì)都是先升高后降低，在30 ℃時(shí)ACE抑制率均達(dá)到最大值70.4%；隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加ACE抑制率先升高后降低，在100 r/min時(shí)ACE抑制率最大值65%。

圖3 不同因素發(fā)酵馬乳的ACE抑制活性Fig. 3 Effect of fermentation conditions on the ACE-inhibiting activity of fermented horse milk

2.5 乳酸菌與酵母菌共發(fā)酵馬乳ACE抑制活性的響應(yīng)面優(yōu)化分析

采用二階模型描述ACE抑制率和不同發(fā)酵條件之間的關(guān)系。Y為ACE抑制活性的預(yù)測(cè)值，X1、X2、X3和X4分別為發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量和轉(zhuǎn)速的實(shí)際值。獲得響應(yīng)值A(chǔ)CE抑制率的回歸模型方程式為：

表6 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 6 Analysis of variance of quadratic polynomial model and significance test

由表6可知，模型顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.957 7，校正決定系數(shù)R2為0.920 6，說明該模型擬合度較高。各因素對(duì)發(fā)酵馬乳ACE抑制率的影響程度從強(qiáng)到弱依次為：發(fā)酵時(shí)間＞轉(zhuǎn)速＞發(fā)酵溫度＞接種量。結(jié)合表中F值可知，發(fā)酵溫度（X1）、發(fā)酵時(shí)間（X2）和轉(zhuǎn)速（X4）對(duì)ACE抑制率線性效應(yīng)極顯著（P＜0.01），且對(duì)響應(yīng)值的曲面效應(yīng)極顯著，而接種量（X3）線性效應(yīng)（P=0.343）和響應(yīng)值的曲面效應(yīng)不顯著。參數(shù)間的交互效應(yīng)也會(huì)對(duì)響應(yīng)值A(chǔ)CE抑制率產(chǎn)生影響，交互項(xiàng)X1X4的P值為0.001 1，表明發(fā)酵溫度與轉(zhuǎn)速的相互作用對(duì)ACE抑制率有顯著影響。如圖4所示，當(dāng)發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速向最優(yōu)點(diǎn)增加時(shí)，ACE抑制率顯著增加，溫度在24.8～31.4 ℃、轉(zhuǎn)速在60～190 r/min之間時(shí)ACE抑制率處于較高水平。進(jìn)一步對(duì)以上實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析，溫度29 ℃、發(fā)酵時(shí)間52 h、接種量6%、轉(zhuǎn)速115 r/min為最優(yōu)發(fā)酵條件。

最優(yōu)條件下組合發(fā)酵與單菌發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示，Y7＋L8發(fā)酵結(jié)束后Y7的活菌數(shù)顯著高于Y7單菌發(fā)酵的活菌數(shù)，L8的活菌數(shù)顯著低于L8單菌發(fā)酵的活菌數(shù)。Y7＋L8發(fā)酵的pH值和酸度介于Y7和L8單菌發(fā)酵之間。Y7＋L8發(fā)酵馬乳的水解度為0.65 mg/mL，ACE抑制率為80.67%，均顯著高于單菌發(fā)酵。

圖4 發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵馬乳ACE抑制活性影響的響應(yīng)面圖Fig. 4 Response surface plot for the interactive effects of fermentation temperature and rotation speed on the ACE-inhibiting activity of fermented horse milk

表7 乳酸菌與酵母菌單菌和共發(fā)酵ACE抑制活性及發(fā)酵特征比較Table 7 Comparison of ACE-inhibiting activity and fermentation characteristics between single-strain and mixed-strain fermentation

2.6 乳酸菌與酵母菌發(fā)酵馬乳對(duì)蛋白組成的影響

圖5 單菌發(fā)酵與共發(fā)酵的蛋白水解情況Fig. 5 Protein hydrolysis during single-strain fermentation and co-fermentation

單菌發(fā)酵與共發(fā)酵馬乳的SDS-PAGE如圖5所示，總體上Y7和L8單菌發(fā)酵馬乳與原馬乳相比蛋白有輕微的水解，其中Y7對(duì)蛋白的水解強(qiáng)于L8；Y7＋L8共發(fā)酵對(duì)馬乳蛋白的水解能力顯著增強(qiáng)。參考Egito等[22]對(duì)馬乳中β-酪蛋白的鑒定，分子質(zhì)量為25.5 kDa左右的β-酪蛋白幾乎被完全水解，參考包艷青[23]對(duì)馬乳乳清蛋白的鑒定，分子質(zhì)量為18.5 kDa左右乳清蛋白部分水解，但分子質(zhì)量為14.2 kDa左右的β-乳球蛋白幾乎沒有水解。RP-HPLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，L8和Y7單菌發(fā)酵對(duì)馬乳蛋白的水解能力很弱，其中Y7的水解能力強(qiáng)于L8。Y7＋L8組合發(fā)酵對(duì)馬乳蛋白的水解能力顯著增強(qiáng)，結(jié)果與水解度和SDSPAGE的結(jié)果一致。

圖6 單菌發(fā)酵與共發(fā)酵的蛋白R(shí)P-HPLC圖譜Fig. 6RP-HPLC profiles of proteins in fermented milk produced by single-strain or co-fermentation

2.7 馬乳發(fā)酵產(chǎn)物ACE抑制組分的分離

組合發(fā)酵馬乳后經(jīng)葡聚糖G-25凝膠色譜對(duì)粗提物進(jìn)行分離，得到4 個(gè)峰，如圖7所示。分別對(duì)4 個(gè)峰進(jìn)行收集凍干，并以20 mg/mL質(zhì)量濃度溶于去離子水中進(jìn)行ACE抑制率的測(cè)定。如圖8所示，4 個(gè)峰對(duì)ACE的抑制率分別為86%、30.5%、15%和24%。其中1號(hào)峰對(duì)ACE的抑制率顯著高于其他3 個(gè)峰，因此選取1號(hào)峰進(jìn)行后續(xù)的分離純化。

圖7 葡聚糖G-25凝膠色譜分離圖譜Fig. 7 Separation of ACE inhibiting peptides in fermented horse milk by Sephadex G-25 chromatography

圖8 葡聚糖G-25凝膠色譜分離所得各組分的抑制率Fig. 8 ACE-inhibiting activity of fractions from Sephadex G-25 chromatography

2.8 馬乳發(fā)酵產(chǎn)物ACE抑制活性組分的耐消化特性

對(duì)葡聚糖G-25凝膠色譜分離的1號(hào)峰進(jìn)行體外模擬胃消化及胃腸消化，HPLC如圖9所示，體外模擬胃消化與未消化相比保留時(shí)間短的肽段變化不明顯，一些保留時(shí)間長(zhǎng)的疏水性強(qiáng)的肽段被水解為更多親水短肽；經(jīng)體外模擬胃腸消化后的肽段和疏水性肽段都明顯增多，水解液的活性隨之加強(qiáng)。測(cè)定消化前、胃消化及胃腸消化后的ACE半抑制濃度分別為 4.77、3.11 mg/mL和2.02 mg/mL，經(jīng)過胃消化和胃腸消化后ACE半抑制濃度逐漸降低，ACE抑制率增強(qiáng)（圖10）。

圖9 高活性組分體外模擬胃腸消化前后的肽譜變化Fig. 9 Changes in peptide profile before and after in vitro gastrointestinal digestion of ACE-inhibiting peptide

圖10 高活性組分體外模擬胃腸消化前后半抑制濃度的變化Fig. 10 Changes in IC50 of ACE-inhibiting peptide before and after in vitro gastrointestinal digestion

3 討 論

近年來隨著對(duì)乳源活性肽的研究，開發(fā)具有生物活性的發(fā)酵乳產(chǎn)品和篩選乳源生物活性肽逐漸成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。食源性ACE抑制肽是備受關(guān)注的生物活性肽，有研究表明用不同的乳酸菌發(fā)酵牛乳[24-25]、羊乳[26-27]和馬乳[28]能夠獲得ACE抑制肽。也有研究報(bào)道用來自傳統(tǒng)酸馬乳的酵母菌發(fā)酵牛乳能產(chǎn)ACE抑制肽[29-30]，然而用酵母菌單獨(dú)發(fā)酵馬乳或乳酸菌和酵母菌共發(fā)酵馬乳產(chǎn)ACE抑制肽的研究鮮見報(bào)道。酵母菌是重要的乳源微生物資源，尤其在傳統(tǒng)含醇發(fā)酵乳如開菲爾、酸馬乳中的酵母菌是不可缺少的功能菌種，其數(shù)量可達(dá)106CFU/mL[15]，而且與只用乳酸菌發(fā)酵的發(fā)酵乳不同的是酸馬乳在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用中具有降血壓作用[4]。本研究通過從傳統(tǒng)酸馬乳中篩選的酵母菌發(fā)酵馬乳，發(fā)酵馬乳的ACE抑制率最高達(dá)到50%，高于乳酸菌發(fā)酵的馬乳所能達(dá)到的最高水平37.33%。說明酵母菌發(fā)酵馬乳不僅能釋放出ACE抑制肽，而且酵母菌的蛋白水解酶酶切位點(diǎn)可能更有利于水解馬乳蛋白釋放出特定ACE抑制肽。

傳統(tǒng)的含醇發(fā)酵乳制品是由多種乳酸菌和酵母菌等微生物自然發(fā)酵而成的，它們?cè)陂L(zhǎng)期適應(yīng)乳環(huán)境和發(fā)酵條件的過程中形成了特定的共生關(guān)系[31]，這樣不僅給發(fā)酵乳賦予了豐富而獨(dú)特的風(fēng)味特征，而且可能帶來更加多樣的生物活性。本研究使用乳酸乳球菌與解脂耶氏酵母共發(fā)酵馬乳通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件之后其ACE抑制率為80.67%，比單獨(dú)酵母的提高了29.34%，比乳酸菌提高了42%。共發(fā)酵52 h后解脂耶氏酵母的活菌數(shù)為7.37（lg（CFU/mL））顯著高于解脂耶氏酵母單獨(dú)發(fā)酵的活菌數(shù)7.07（lg（CFU/mL）），乳酸乳球菌的活菌數(shù)為7.90（lg（CFU/mL））顯著低于乳酸乳球菌單獨(dú)發(fā)酵的活菌數(shù)8.53（lg（CFU/mL））。共發(fā)酵的pH值介于單菌發(fā)酵之間，水解度顯著高于單菌發(fā)酵。共發(fā)酵體系中的乳酸乳球菌對(duì)解脂耶氏酵母的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，從而增加了酵母菌對(duì)乳蛋白的水解，而解脂耶氏酵母對(duì)乳酸乳球菌的生長(zhǎng)有抑制作用。王小標(biāo)等[32]研究證明乳酸菌在馬乳中的生長(zhǎng)代謝過程降低了乳制品的pH值，提供一個(gè)適宜的酸性環(huán)境促進(jìn)了酵母菌的生長(zhǎng)，而酵母菌分解脂肪生成的脂肪酸會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)。Chaves-Lopez等[30]用酵母菌、植物乳桿菌和糞腸球菌共發(fā)酵也能夠提高發(fā)酵ACE抑制肽的產(chǎn)生。本研究水解馬乳蛋白能力高的菌株普遍ACE抑制率也高，而且主要水解的是馬乳β-酪蛋白，說明蛋白水解度和ACE抑制率之間存在相關(guān)性，ACE抑制組分可能來源于馬乳的β-酪蛋白。Chen等[14]從傳統(tǒng)酸馬乳中分離出的ACE抑制肽來源于馬乳的β-酪蛋白（f213～241）證明了β-酪蛋白是較好的ACE抑制肽來源蛋白。

食源性生物活性肽只有被腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)才能發(fā)揮其相應(yīng)的作用，然而在此過程中肽分子會(huì)受到胃腸消化酶的水解作用，因此生物活性肽經(jīng)過胃腸道消化后能否保持其活性至關(guān)重要。Iroyukifujita等[33]對(duì)ACE抑制肽經(jīng)胃腸消化后的抑制效果進(jìn)行了研究，將經(jīng)過胃腸道消化后抑制活性增強(qiáng)的物質(zhì)稱為前藥。本實(shí)驗(yàn)用乳酸菌與酵母菌共發(fā)酵馬乳分離得到的ACE抑制組分經(jīng)過胃腸消化后，其半抑制濃度從4.77 mg/mL降至2.02 mg/mL。該活性組分不僅能夠抵抗胃腸消化，而且經(jīng)胃腸消化后活性顯著提高，在體內(nèi)具有發(fā)揮較好降壓作用的潛能，屬于前藥類。王宇等[34]用乳酸菌發(fā)酵的牛乳具有ACE抑制活性并能很好地抵抗胃腸消化，與本研究結(jié)果相似。然而，ACE抑制肽在體內(nèi)的作用效果及其作用機(jī)制需要繼續(xù)進(jìn)行活性肽的分離并用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究利用特定的乳酸菌與酵母菌共發(fā)酵馬乳，獲得了在體外具有降壓作用的肽組分。說明了馬乳能作為ACE抑制肽的蛋白來源，除此之外，進(jìn)一步證實(shí)了酵母菌能夠釋放ACE抑制肽，并且酵母菌與乳酸菌的共生系統(tǒng)能夠更好地發(fā)揮該作用。研究結(jié)果對(duì)更廣泛挖掘利用微生物資源具有重要意義和價(jià)值，也為闡明酸馬乳降壓作用的機(jī)制提供了新視角。