LC-MS定量研究白樺脂酸的體外細(xì)胞攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)

陳 旺， 王美慧， 帥麗霞， 詹 雁， 譚 鐳， 阮 佳， 徐超群

(1. 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041; 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

0 引 言

白樺脂酸 (betulinic acid，BA)是廣泛存在于自然界的一種五環(huán)三萜類有機(jī)酸，研究發(fā)現(xiàn)馬甲子[1-2]、酸棗仁[3-4]、白樺樹[5-6]等多種植物中存在BA。BA具有廣泛的抗腫瘤活性，對(duì)黑素瘤[7]、腦膠質(zhì)瘤[8]、胃癌[9]、肺癌[10]、肝癌[11]等多種腫瘤細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性，是對(duì)正常細(xì)胞毒性的5～7倍[12]，尤其對(duì)黑素瘤細(xì)胞有選擇殺傷作用而不殺傷健康細(xì)胞。此外，BA在抗炎[13]、抗菌[14]等方面均表現(xiàn)出良好的活性。但其水溶性差[15]，口服生物利用低[16]，這不僅限制了BA在臨床的應(yīng)用，對(duì)于其含量測(cè)定方法要求更高。目前，測(cè)定BA的常用方法是高效液相色譜法（HPLC）[17-19]，但是HPLC靈敏度較低，無(wú)法滿足生物樣品中BA的微量檢測(cè)。Caco-2細(xì)胞系來(lái)源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，可在培養(yǎng)過(guò)程中自發(fā)形成具有與小腸上皮細(xì)胞相似的微絨毛和緊密連接的單細(xì)胞層，Caco-2細(xì)胞不僅在形態(tài)、生化特征與人小腸相似，還具有相似的轉(zhuǎn)運(yùn)體、代謝酶以及滲透特性[20]，研究BA在Caco-2細(xì)胞的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理有助于揭示BA在腸吸收機(jī)制。本文采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)，首次建立了BA在細(xì)胞中的含量測(cè)定方法，并對(duì)其方法學(xué)進(jìn)行考察；通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立Caco-2細(xì)胞模型，并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)特征、跨膜電阻值等指標(biāo)篩選出可用模型，分別用于攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定細(xì)胞中BA含量，研究其攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)特性，并考察轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑維拉帕米和丙磺舒對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取的影響。本實(shí)驗(yàn)首次建立了細(xì)胞樣品中BA含量的LC-MS分析方法，能準(zhǔn)確在細(xì)胞水平測(cè)定BA含量，可為其在Caco-2細(xì)胞的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)研究提供可靠分析方法。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

BA（純度≥98%，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，PRF10122722）；BA對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，111802-201703）；齊墩果酸（中國(guó)藥物生物制品檢定所，110709-200304）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher）；其他試劑為分析醇，純凈水為怡寶純凈水。

1.2 儀器

1290高效液相色譜儀（Agilent，USA）；6460 Triple Quad LC/MS（ Agilent， USA） ； AC2-4S1 AirsteamII級(jí) A2型生物安全柜（ESCO，Singapore）；CO2培養(yǎng)箱（ESCO，Singapore）；S40-SLIDER倒置光學(xué)顯微鏡（Leica Portugal，Germany）；Varioskan LUX 酶標(biāo)儀（Thermo Scientific，USA）；L2-6K 臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司，中國(guó)）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Invitrogen）；MERS00002細(xì)胞電阻儀（Millicell，USA）；XS205 DualRange型分析天平(Mettler Toledo公司，瑞士)；真空干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)）；3K15低溫高速離心機(jī)（Sigma，Germany）；T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶（NEST）；96孔板（NEST）；細(xì)胞小室 Transwell培養(yǎng)板（Corning Inc，USA，12孔聚碳酸酯膜，孔徑 0.4 μm）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

將Caco-2細(xì)胞接種于Transwell板中，按照常規(guī)培養(yǎng)條件和方法[21]培養(yǎng)20～22 d，測(cè)定計(jì)算其跨膜電阻值（TEER）以檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性，取TEER值大于450 Ω·cm2的孔，按跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)要求[21]處理后進(jìn)行藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，于實(shí)驗(yàn)后測(cè)定計(jì)算各孔TEER值，舍棄TEER值小于450 Ω·cm2的孔。

2.2 細(xì)胞攝取

取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的Caco-2細(xì)胞，按攝取培養(yǎng)要求[22]處理后進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，以考馬斯亮藍(lán)法定量樣品中蛋白含量，LC-MS定量樣品中BA含量，結(jié)果以每毫克蛋白質(zhì)藥物攝取量（μg/mg）表示。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱Agilent SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），柱溫 35 ℃，流動(dòng)相 0.1% 甲酸水-甲醇（22∶78，v/v），流量0.3 mL/min，進(jìn)樣量1 μL；檢測(cè)模式：電噴霧離子化（ESI），采用選擇性負(fù)離子檢測(cè)方式，檢測(cè)離子為 BA和齊墩果酸（m/z均為455.4），噴霧壓力：40 psi（1 psi=6.895 kPa），干燥器流量：10 L/min，干燥器溫度：350 ℃，檢測(cè)電壓：4 000 V。切入時(shí)間6 min，切出時(shí)間12 min。

2.4 溶液的制備

2.4.1 對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液制備

稱取BA對(duì)照品8.40 mg，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成質(zhì)量濃度84 μg/mL的BA儲(chǔ)備液，-20 ℃儲(chǔ)藏備用。使用時(shí)稀釋成適當(dāng)濃度的對(duì)照品工作液。稱取齊墩果酸對(duì)照品9.60 mg，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成質(zhì)量濃度96 μg/mL的齊墩果酸儲(chǔ)備液，-20 ℃儲(chǔ)藏備用。使用時(shí)稀釋成終濃度為9.6 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.4.2 空白細(xì)胞液制備

分別用HBSS緩沖液（含3%的泊洛沙姆188）和雙蒸水孵育Caco-2細(xì)胞2 h即得。

2.4.3 對(duì)照與質(zhì)控樣品制備

取BA儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋配制成質(zhì)量濃度為8.4，16.8，33.6，84，168，252，504，840 ng/mL 系列溶液，取上述稀釋溶液200 μL，50 ℃氮?dú)獯蹈珊笤俜謩e加入等體積的空白細(xì)胞液，混勻得對(duì)照品溶液，另取33.6，168，504 ng/mL BA溶液同法操作制得質(zhì)控樣品。

2.4.4 樣品前處理方法

取200 μL細(xì)胞懸液樣品于10 mL的離心管中，先加入 5 μL 內(nèi)標(biāo)的齊墩果酸（9.6 μg/mL），混勻后加入2 mL乙酸乙酯，渦旋15 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液50 ℃氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤?00 μL甲醇溶液復(fù)溶，渦旋5 min，13 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液進(jìn)樣，LC-MS測(cè)定。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21. 0，繪制作圖采用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示。用單因素方差分析比較多組之間的差異，*P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，**P＜0.01為具有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性

取細(xì)胞攝取陰性溶液、細(xì)胞攝取供試品溶液、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)陰性溶液、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)供試品溶液以及混合對(duì)照品溶液，在本實(shí)驗(yàn)的LC-MS條件下分析，BA和內(nèi)標(biāo)齊墩果酸的保留時(shí)間分別為7.7 min和8.8 min，細(xì)胞中內(nèi)源性物質(zhì)不會(huì)對(duì)待測(cè)成分產(chǎn)生干擾，峰形良好，見圖1。

圖1 細(xì)胞攝取陰性溶液（A）、細(xì)胞攝取供試品溶液（B）、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)陰性溶液（C）、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)供試品溶液（D）、混合對(duì)照品溶液（E）LC-MS圖（1：BA；2：內(nèi)標(biāo)）

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

精密吸取“2.4.3”項(xiàng)下的不同濃度的對(duì)照品溶液，按照“2.4.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行LC-MS分析。采用加權(quán)最小二乘法（1/C），以BA峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)和進(jìn)樣濃度（X）進(jìn)行線性回歸方程，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。攝取實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y=0.007X+0.131(r=0.997)，Y=0.007X+0.071(r=0.998)，線性范圍為 8.4～840 ng/mL，線性關(guān)系良好。

3.1.3 精密度與準(zhǔn)確度

取“2.4.3”項(xiàng)下的 BA 質(zhì)控樣品，按照“2.4.4”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度平行6份，分別于第1天和第5天測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)精密度、日間精密度，以實(shí)測(cè)濃度和真實(shí)濃度相比得回收率表示準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BA和內(nèi)標(biāo)的日內(nèi)、日間精密度 RSD 為3%～10%，回收率為 95%～110%，均符合生物樣品分析的方法要求 （如表1所示）。

表1 精密度和準(zhǔn)確度（n=6）

3.1.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

取空白細(xì)胞液，不加內(nèi)標(biāo)按照“2.4.4”項(xiàng)下方法處理后向殘留物中加入200 μL濃度為504，168，33.6 ng/mL BA溶液和5 μL內(nèi)標(biāo)溶液，50 ℃氮吹干燥后200 μL甲醇復(fù)溶，進(jìn)樣測(cè)定得峰面積A；取BA質(zhì)控樣品按“2.4.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定得峰面積B；取 200 μL 濃度為 504，168，33.6 ng/mL BA溶液和5 μL內(nèi)標(biāo)溶液，50 ℃氮吹干燥后200 μL甲醇復(fù)溶后進(jìn)樣測(cè)定得峰面積C，每個(gè)濃度平行6個(gè)樣品，基質(zhì)效應(yīng)=峰面積A/峰面積C×100%，提取回收率=峰面積B/峰面積A×100%。BA的基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率分別在107.9%～114.5%和97.2%～103.0%范圍內(nèi)，RSD均＜10%，符合生物樣品分析要求（如表2所示）。

表2 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率（±S ，n=6）

表2 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率（±S ，n=6）

項(xiàng)目 樣品 質(zhì)量濃度/（ng·mL-1）基質(zhì)效應(yīng)/%RSD/%提取回收率/%RSD/%細(xì)胞攝取 BA 504 109.6±3.16 5.50 97.2±0.46 9.03 168 107.9±1.32 6.08 98.4±1.35 6.97 33.6 114.5±2.33 9.54 100.6±1.80 7.76齊墩果酸 240 110.7±2.70 7.92 96.6±0.94 7.98細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn) BA 504 108.7±2.59 3.25 100.1±1.07 4.56 168 108.1±1.72 6.98 100.8±4.91 7.32 33.6 114.3±3.46 7.12 103.0±3.08 6.83齊墩果酸 240 108.7±2.14 8.46 101.3±1.10 5.64

3.1.5 穩(wěn)定性

取“2.4.3”項(xiàng)下的BA溶液質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度樣品平行6份，分別考察BA質(zhì)控樣品的室溫穩(wěn)定性（25 ℃，24 h）、長(zhǎng)期穩(wěn)定性（-80 ℃ 冰箱放置30 d）、凍融穩(wěn)定性（-80 ℃，反復(fù)凍融循環(huán) 3 次），以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)控樣品濃度，并計(jì)算準(zhǔn)確度，結(jié)果見表3、圖2、圖3。結(jié)果顯示上述條件下RSD值均＜10%，表明BA質(zhì)控樣品溶液均能在上述條件下保持穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性（±S ，n=6）

表3 穩(wěn)定性（±S ，n=6）

BA質(zhì)量濃度/（ng·mL-1）率/% RSD/% 回收室溫穩(wěn)定性 長(zhǎng)期穩(wěn)定性 凍融穩(wěn)定性回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/%504 115.0±2.11 5.98 113.5±5.76 4.07 107.3±4.57 3.53 168 108.3±3.80 7.34 97.6±5.12 7.86 98.4±3.21 2.74 33.6 102.4±3.25 4.78 99.4±6.23 5.18 103.2±3.84 8.48

圖2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性

圖3 凍融穩(wěn)定性

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 細(xì)胞攝取

將 Caco-2細(xì)胞分別與 100，175，250 μg/mL BA供試液以及250 μg/mL BA供試液與維拉帕米、丙磺舒的混合試液培養(yǎng)，結(jié)果見圖4。BA攝取量隨著濃度的增加而增大，呈一定濃度依賴性（P＜0.05）。加入維拉帕米、丙磺舒共培養(yǎng)，BA攝取量與未加藥物的對(duì)照組比較，沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明BA的攝取不受維拉帕米和丙磺舒的影響。

圖4 Caco-2細(xì)胞藥物攝取實(shí)驗(yàn)

3.2.2 藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)

不同濃度BA跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5、圖6所示，AP→BL 時(shí)，BA 的Papp值為 1.31×10-7～1.40×10-7cm/s；BL→AP 時(shí)，BA 的Papp值為 1.50×10-7～1.61×10-7cm/s。兩側(cè)的Papp值均隨濃度的增加變化不大（P＞0.05），且外排率均＜1.5。在加入維拉帕米、丙磺舒轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑之后，BA的Papp值與未加入轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑的對(duì)照組相比，沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），表明BA的轉(zhuǎn)運(yùn)不受轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑的影響。

圖5 Caco-2細(xì)胞藥物在AP→BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

圖6 Caco-2細(xì)胞藥物在BL→AP側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

4 討 論

前期，有學(xué)者[21]也采用LC-MS建立起B(yǎng)A的含量測(cè)定方法，但主要是針對(duì)大鼠血漿中BA的含量測(cè)定，而在本研究中主要是針對(duì)于HBSS細(xì)胞攝取液和轉(zhuǎn)運(yùn)液樣品中BA的含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)前期考察發(fā)現(xiàn)BA的HPLC檢測(cè)定量限約為4 μg/mL，而樣品中BA濃度遠(yuǎn)低于HPLC定量限，故研究選用采用LC-ESI-MS檢測(cè)BA含量，并對(duì)其方法學(xué)進(jìn)行了驗(yàn)證，該方法測(cè)得的目標(biāo)成分的內(nèi)源性雜質(zhì)干擾小，峰形對(duì)稱，分離度好，是一種較為快速、高效、靈敏的含量測(cè)定方法。

通過(guò)建立靈敏度高、特異性強(qiáng)的細(xì)胞攝取液和轉(zhuǎn)運(yùn)液中BA濃度的LC-MS測(cè)定方法，設(shè)置不同濃度以及相同濃度下不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑等考察因素，探究BA在Caco-2細(xì)胞中的攝取和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)情況。攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BA攝取存在濃度依賴性，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑維拉帕米和丙磺舒的加入對(duì)BA的單位蛋白攝取量無(wú)顯著影響；在轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，100，175，250 μg/mL的BA從AP側(cè)到BL側(cè)及BL側(cè)到AP側(cè)的Papp值隨濃度的增加無(wú)顯著變化，而且ER＜1.5?？梢酝茢郆A主要是通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散的方式吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，呈濃度依賴性。藥物在Caco-2細(xì)胞模型上的表觀滲透系數(shù)Papp與其口服吸收率密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BA的Papp＜1×10-6cm/s，表明BA屬于吸收極差的化合物[23]，推測(cè)BA在人體的吸收率小于20%，這和BA較低的口服生物利用度的結(jié)果一致。加入維拉帕米和丙磺舒，BA 的Papp（AP-BL）值、Papp（BL-AP）值無(wú)顯著差異，由此可推斷，BA不是P-糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白的底物。綜上，BA是一種口服吸收率極差的化合物，在Caco-2細(xì)胞中的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)為被動(dòng)擴(kuò)散，且不是P-糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白的底物。

5 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)成功建立了用LC-MS準(zhǔn)確測(cè)定Caco-2細(xì)胞中BA含量的實(shí)驗(yàn)方法。該方法在-ESI離子化方式下，以齊墩果酸為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)BA的碎片離子m/z455.4進(jìn)行定量分析。該方法穩(wěn)定性良好，靈敏度高、提取回收率高，生物樣本中內(nèi)源性雜質(zhì)無(wú)干擾，能有效應(yīng)用于Caco-2細(xì)胞中BA的定量分析。本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS法對(duì)BA在Caco-2細(xì)胞上的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行研究，預(yù)測(cè)BA在腸吸收情況，為合理設(shè)計(jì)其口服制劑研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及理論支持。