1株可裂解blaNDM-5及mcr-1陽性大腸桿菌噬菌體的分離與生物學特性

劉 暢，劉 教，陳 進，王勉之，熊文廣，曾振靈*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642；2.廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室，廣州 510624；3.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009)

噬菌體被稱為細菌病毒，必須寄生于特定的活菌體內(nèi)。其個體微小，僅由核酸和蛋白質外殼構成。噬菌體在自然界中分布廣泛，數(shù)量超過1031個[1]，分布于水體、土壤、人體及畜禽腸道等各種環(huán)境中[2]，有細菌的地方就有噬菌體的存在。相對于其他生態(tài)環(huán)境，水環(huán)境中的噬菌體的數(shù)量最多[3]。根據(jù)其繁殖特點，噬菌體可被分為裂解性噬菌體和溶原性噬菌體兩大類。

近年來，細菌耐藥問題日益嚴峻，多重耐藥菌株檢出率逐年增加，甚至出現(xiàn)同時攜帶blaNDM-5及mcr-1這樣的“超級細菌”[4]，嚴重危害人類和畜禽健康，解決抗生素耐藥問題已變得刻不容緩。噬菌體作為一種天然“抗菌藥物”，其制劑的毒性低，特異性強和開發(fā)周期短等，被視為“后抗生素時代”很好的治療手段和生態(tài)環(huán)境凈化制劑[5]。用于“噬菌體治療”的是裂解性噬菌體，“噬菌體治療”概念的提出最早可以追溯到20世紀20年代，但因為第二次世界大戰(zhàn)和抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)，轉移了人們對“噬菌體治療”的關注[6]，一定程度上制約了它的發(fā)展，直至近10年，噬菌體再次獲得了人們的關注[7]。目前,運用噬菌體治療多重耐藥細菌感染病患已取得了令人振奮的成果[8-9]，這些成果不僅證實了噬菌體治療的可行性，也暗示著噬菌體在獸醫(yī)生產(chǎn)臨床上也具有極大的應用潛力。

廣東家禽養(yǎng)殖環(huán)境復雜，抗菌藥物的不合理使用，使得多重耐藥菌株不斷檢出[10]，也給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，嚴重挑戰(zhàn)了獸醫(yī)臨床上對抗大腸桿菌的有效藥物的選擇。為了解決上述問題，本研究提出利用禽源多重耐藥大腸桿菌為宿主菌，以從養(yǎng)殖場池塘水中采集樣品為研究對象，試圖分離出可裂解攜帶blaNDM-5及mcr-1耐藥基因大腸桿菌的噬菌體，并對其生物學特性進行研究，解析其全基因組序列，旨在為養(yǎng)殖場中blaNDM-5及mcr-1陽性大腸桿菌的防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

菌株：宿主菌為華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)藥理研究室分離并保存的禽源多重耐藥大腸桿菌GZB8C146-1M，菌株詳細信息如表1所示。

表1 GZB8C146-1M菌株信息

池塘水樣品來源：廣東肇慶某家禽養(yǎng)殖場所采集的池塘水。

1.2 主要試劑

麥康凱瓊脂和LB肉湯等均購于廣州環(huán)凱微生物有限公司。

SM緩沖液：稱取NaCl 4.68 g，MgSO41.58 g，Tris 4.85 g，明膠0.016 g，加入去離子水充分溶解，調節(jié)pH至7.5，定容至800 mL，高壓滅菌后使用。

噬菌體DNA提取試劑盒購于Omega公司。

1.3 樣品的處理

將采集回來的鴨場污水離心除去大顆粒雜質，依次使用5.00、1.20、0.45、0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，通過Millipore Pellicon XL超濾膜將濾液濃縮為50 mL的液體，即為噬菌體母液，-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 噬菌體的分離與純化

分別取100 μL噬菌體母液和100 μL對數(shù)期菌懸液加入至2 mL LB肉湯中，37 ℃、160 r·min-1搖床中培養(yǎng)4 h，6 000×g離心5 min，0.22 μm 濾膜除菌后再加入100 μL菌懸液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心過膜除菌，如此重復3次，得到富集液。將富集液用SM緩沖液倍比稀釋一定倍數(shù)后，加入等體積的菌懸液，靜置培養(yǎng)30 min后制作雙層平板，37 ℃培養(yǎng)6～8 h，若瓊脂平板上顯現(xiàn)出噬菌斑，挑取單個透亮圓潤的噬菌斑，加入1 mL SM緩沖液中，渦旋混勻后過膜除菌，制作雙層平板進行純化，此步驟約重復3次，直至得到大小均一的噬菌斑。

1.5 噬菌體的透射電鏡觀察

將封口膜平鋪在玻璃片上，用鑷子把銅網(wǎng)夾至封口膜上，使用移液槍取10 μL噬菌體富集液滴在銅網(wǎng)上，靜置10 min后，用濾紙吸去多余液體后，取10 μL 2%磷鎢酸滴在銅網(wǎng)上，靜置1～3 min后，用濾紙吸去多余液體。室溫放置干燥后，放置透射電鏡(型號：日本電子JEOL JEM-1200EX)觀察，并進行拍照記錄。

1.6 噬菌體的最佳感染復數(shù)(OMOI)測定

大腸桿菌菌液培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600nm=0.3～0.4)，噬菌體液富集3次備用，完成細菌和噬菌體計數(shù)后，在2 mL離心管中分別加入100 μL稀釋后的菌懸液，按照噬菌體∶細菌(P∶B)=10∶1、1∶1、10-1∶1、10-2∶1、10-3∶1、10-4∶1的數(shù)量比例加入倍比稀釋后噬菌體(每個比例作3個重復)。在37 ℃、160 r·min-1搖床中培養(yǎng)4 h后，進行噬菌體的效價測試，滴度最高的組對應的MOI，即為最佳感染復數(shù)。

1.7 噬菌體的一步生長曲線的測定

在2 mL離心管中加入1 mL的細菌菌懸液，按照P∶B=10的比例，加入富集后的噬菌體液，37 ℃靜置15 min，10 000 ×g離心30 s棄去上清液后，加入1 mL LB液體培養(yǎng)基迅速吹打菌體沉淀，離心棄上清，重復洗滌2次，加入1 mL LB液體培養(yǎng)基并吹打沉淀，轉移混合液至LB肉湯試管中(總體積5 mL)，放置37 ℃、180 r·min-1搖床中培養(yǎng)，每間隔10 min取200 μL培養(yǎng)液，離心過膜處理后，測定培養(yǎng)液中噬菌體的效價，一共持續(xù)取樣測定90 min，本試驗設置3組平行。根據(jù)爆發(fā)量計算公式：爆發(fā)量=爆發(fā)末期噬菌體滴度/感染初期宿主菌濃度，計算試驗結果結果，并繪制噬菌體的一步生長曲線圖。

1.8 噬菌體的溫度穩(wěn)定性測定

將1 mL噬菌體富集液(每組設3個重復)分別置于4 ℃冰浴及37、45、50、55、60、70 ℃的水浴鍋中處理1 h后，對樣品進行倍比稀釋，測定不同溫度處理后的噬菌體效價。

1.9 噬菌體的pH穩(wěn)定性測定

配制pH為1～12的LB肉湯，將100 μL噬菌體富集液分別加入到不同pH的1 mL LB肉湯中(每組設3個重復)，37 ℃、180 r·min-1搖床下孵育1 h后，測定不同pH條件下處理后的噬菌體效價。

1.10 宿主譜測定

挑取本實驗室中102株與GZB8C146-1M同一批分離出的blaNDM-5陽性大腸桿菌和大腸桿菌標準菌株ATCC 25922，其中12株大腸桿菌同時攜帶blaNDM-5和mcr-1耐藥基因，采用點樣法測定噬菌體的宿主譜。取100 μL對數(shù)期菌液加入5 mL半固體中，搖晃均勻后靜置放涼即得到試驗所需的雙層平板，將2 μL噬菌體液點板于雙層平板上，37 ℃培養(yǎng)6～8 h后，讀取試驗結果。

1.11 噬菌體的全基因組測序及生物信息學分析

使用Omega公司病毒提取試劑盒進行噬菌體DNA的提取，DNA樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行二代測序。將測序結果導入CLC Genomics Workbench 10.1，通過De Novo Assembly進行拼接，獲得contigs，用于進一步分析。利用RAST(https://rast.nmpdr.org/rast.cg)和NCBI中的BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)注釋和驗證ORF；利用MEGAX軟件及NCBI中BLAST比對相似的10組噬菌體序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹；利用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫CGE(https://cge.cbs.dtu.dk/services/)進行耐藥基因和毒力基因的查找。

2 結 果

2.1 噬菌體的分離與純化

以同時攜帶blaNDM-5及mcr-1陽性大腸桿菌GZB8C146-1為宿主菌，從鴨場污水中分離純化出1株噬菌體，將其命名為vB_EcoM-ZQ1(圖1A)。

2.2 噬菌體的透射電鏡觀察

透射電鏡結果(圖1B)顯示，vB_EcoM-ZQ1具有較為典型的二十面體頭部和尾部，噬菌體全長大小約為180 nm，其中，頭部約為72 nm，尾部約為108 nm。通過電鏡觀察和全基因組測序分析，該噬菌體屬于有尾病毒目，肌尾噬菌體科。

A.噬菌體vB_EcoM-ZQ1的噬菌斑；B.噬菌體vB_EcoM-ZQ1的透射電鏡圖

2.3 噬菌體的最佳感染復數(shù)(OMOI)

根據(jù)表2所示結果可知，當感染復數(shù)(MOI)為0.1時，噬菌體vB_EcoM-ZQ1效價最高，為6.7×1011PFU·mL-1，所以噬菌體vB_EcoM-ZQ1的最佳感染復數(shù)為0.1。

表2 噬菌體vB_EcoM-ZQ1最佳感染復數(shù)的測定

2.4 噬菌體的一步生長曲線

由圖2可知，噬菌體vB_EcoM-ZQ1的潛伏期為20 min，在這期間噬菌體的效價雖有增長，但是總體趨勢較緩慢。在20～30 min，噬菌體效價急劇增加，持續(xù)時間10 min后，噬菌體又趨于穩(wěn)定增長。根據(jù)公式可得噬菌體vB_EcoM-ZQ1的裂解量大約為92 PFU·cell-1。

圖2 噬菌體vB_EcoM-ZQ1的一步生長曲線

2.5 噬菌體的溫度穩(wěn)定性

由圖3A可知，噬菌體vB_EcoM-ZQ1在4～55 ℃，噬菌體的效價變化不大，較為穩(wěn)定。60 ℃時，噬菌體效價出現(xiàn)明顯下降，在70 ℃時，觀察不到噬菌體的存活，說明在該溫度下，噬菌體vB_EcoM-ZQ1的活力被嚴重破壞。

2.6 噬菌體的pH穩(wěn)定性

如圖3B所示，噬菌體vB_EcoM-ZQ1在pH耐受范圍為4～10，噬菌體對pH有較寬的耐受性，當pH低于3或高于11時，并未發(fā)現(xiàn)存活的噬菌體，說明噬菌體vB_EcoM-ZQ1不耐強酸和強堿。

A.噬菌體vB_EcoM-ZQ1溫度穩(wěn)定性試驗結果；B.噬菌體vB_EcoM-ZQ1pH穩(wěn)定性試驗結果

2.7 噬菌體的宿主譜測定

噬菌體vB_EcoM-ZQ1能裂解26株大腸桿菌，裂解率為25.5%。26株大腸桿菌中，有24株是攜帶blaNDM-5耐藥基因的大腸桿菌，有2株為同時攜帶blaNDM-5和mcr-1耐藥基因。結果說明噬菌體vB_EcoM-ZQ1對多重耐藥細菌有一定的裂解作用，但試驗中也發(fā)現(xiàn)該噬菌體并不能裂解大腸桿菌標準菌株ATCC 25922，試驗所選取菌株信息及裂解情況如表3所示。

表3 宿主譜選用菌株信息及宿主譜測定結果

2.8 噬菌體的基因組學分析

基因組裝后的噬菌體vB_EcoM-ZQ1基因全長149 112 bp，GC含量為49.1%。通過注釋和比對后，該基因組共比對到184個ORF，預測出了2個tRNA，分別為tRNA-Met(CAT)和tRNA-Ser(GCT)?；蚪M中并未預測出耐藥基因和毒力因子，說明了噬菌體ZQ1在臨床上應用的安全性。

在184個ORF中，有70個 ORF是已知功能的基因，其中約35%的基因與噬菌體的結構與組裝有關，如tail spike protein、baseplate wedge subunit、Gp4 head completion protein和Gp13 neck protein等；約61%的基因與噬菌體DNA復制和調控有關，如DNA ligase、putative DNA polymerase和dCMP deaminase等；terminase large subunit、terminase small subunit及Gp20 portal vertex protein of head與噬菌體DNA包裝有關，同時有1個基因putative endolysin與宿主裂解相關(圖4)。

圖4 噬菌體vB_EcoM-ZQ1的基因圖譜

由圖5的發(fā)育進化樹結果顯示，噬菌體vB_EcoM-ZQ1與沙門菌噬菌體pSal-SNUABM-02的親緣關系最近，位于同一分支，其次是沙門菌噬菌體P46FS4，而與腸桿菌噬菌體EspM4VN的親緣關系最遠。

3 討 論

大腸桿菌廣泛分布于養(yǎng)殖場環(huán)境和動物體內(nèi)，大腸桿菌病傳統(tǒng)上采取抗菌藥物進行治療，在這個過程中，由于臨床養(yǎng)殖人員缺乏足夠的理論知識儲備，養(yǎng)殖場細菌耐藥現(xiàn)象較為嚴重[11]?！俺壖毦钡某霈F(xiàn)給抗菌藥物的運用帶來了極大的壓力，也嚴重威脅到了公共衛(wèi)生健康，于是近些年“噬菌體治療”概念被提出，由于噬菌體易獲得、低成本和安全性高等優(yōu)點[12]，“噬菌體治療”也被越來越多人所接受，且逐步形成產(chǎn)業(yè)化試用于臨床[13]。

本研究從鴨場水環(huán)境中成功分離出1株對同時攜帶blaNDM-5及mcr-1耐藥基因的家禽源大腸桿菌有裂解作用的噬菌體vB_EcoM-ZQ1。該噬菌體電鏡下呈現(xiàn)出多面體的頭部和一個可收縮的尾部，噬菌體全長大小約為180 nm，其中，頭部約為72 nm，尾部約為108 nm，屬于有尾病毒目，肌尾噬菌體科噬菌體[14-15]，和基因組分析比對結果相對應，也和葛展霞等[16]報道的噬菌體形態(tài)相似。

噬菌體vB_EcoM-ZQ1在溫度4～55 ℃范圍內(nèi)都能較穩(wěn)定生長，與孫利廠等[17]的報道相比，該噬菌體具有更寬的活性范圍；在pH4～10時，噬菌體vB_EcoM-ZQ1的活性都較高，耐受范圍比楊慧敏等[18]報道的要寬，但當pH低于3或高于11時，并未發(fā)現(xiàn)噬菌體的存活，說明噬菌體不耐強酸和強堿，這一結論與絕大多數(shù)報道一致[19]。噬菌體的最佳感染復數(shù)為0.1，潛伏期為20 min，裂解期為10 min，裂解量為92 PFU·cell-1，噬菌體的裂解期要短于一般文獻報道[20]，但與Thanh 等[21]報道的一步生長曲線相似，并表示該噬菌體能在短時間內(nèi)完成裂解過程，運用于臨床實踐中，能快速殺滅耐藥大腸桿菌[22]。宿主譜試驗中發(fā)現(xiàn)，噬菌體的裂解率為25.5%，低于Zhou等[23]的報道，也不能裂解大腸桿菌標準菌株ATCC 25922，考慮與試驗選用菌株也有一定關系，但對于治療多重耐藥大腸桿菌甚至攜帶blaNDM-5及mcr-1依舊有理論意義。

經(jīng)過全基因組測序分析后，將噬菌體序列上傳至NCBI(NCBI序列號：MW650886)，該噬菌體基因全長149 112 bp，GC含量為49.1%，無明顯的GC偏向性，共有184個ORF，其中有70個ORF是已知功能的基因，表明該基因組絕大部分基因組序列有待研究。噬菌體vB_EcoM-ZQ1中發(fā)現(xiàn)了tRNA的存在，噬菌體依靠吞噬宿主菌獲得增殖，利用宿主菌的tRNA完成自身生物合成的過程[24]，在很長一段時間，噬菌體被認為不攜帶tRNA，但隨著研究的深入和測序技術的發(fā)展，越來越多的噬菌體中發(fā)現(xiàn)了tRNA的存在，Bailly-Bechet等[25]指出tRNA可能在一定程度上能提高噬菌體對宿主菌的裂解能力。但在噬菌體中并未發(fā)現(xiàn)該噬菌體中含有耐藥基因與毒力因子，驗證了該噬菌體運用于獸醫(yī)臨床的安全性。噬菌體vB_EcoM-ZQ1和沙門菌噬菌體pSal-SNUABM-02[26]的親緣關系最近，位于同一分支，與志賀菌phiSboM-AG3[27]有92.37%的相似性，而這些噬菌體的宿主菌分別是志賀菌和腸桿菌，考慮噬菌體vB_EcoM-ZQ1有可能具有裂解其他類型菌的能力，有待進一步探究。

4 結 論

成功篩選出1株對同時攜帶blaNDM-5及mcr-1耐藥基因的家禽源大腸桿菌有裂解作用的噬菌體vB_EcoM-ZQ1，并對其進行了生物學特性和基因組學研究，明確了噬菌體形態(tài)和生物學特征，驗證了運用于獸醫(yī)臨床的可行性，從基因組學角度也證明了該噬菌體的安全性，為后期噬菌體防控blaNDM-5及mcr-1陽性大腸桿菌感染奠定了一定基礎。